耐砷A216T 错义突变型PML-RARα 质粒的构建及雄黄对其蛋白产物影响及机制

潘一鸣 李蕊白 黄子明 刘 宇 费明明 陈凌燕 侯 丽

1.北京中医药大学东直门医院血液肿瘤科，北京 100700；2.温州医科大学检验医学院生命科学学院，浙江温州 325035

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）患者超过90%表现为t（15；17）（q22；q12），产生PML-RARα 融合基因，导致APL 发生[1]。维甲酸和三氧化二砷靶向PML-RARα 使APL 变得可治愈[2]。但10%的APL 患者在治疗后无法获得长期生存，耐药复发是主要原因[3]。耐砷APL 患者PML-RARα 存在错义突变，如A216T 等导致蛋白结构改变引起耐药[4-7]。为研究这一问题，本研究构建了A216T 突变的PML-RARα 质粒（以下简称PMLA216T-RARα，野生型简称为PMLWT-RARα），并研究了砷剂雄黄对其的影响和相关机制。

1 材料及方法

1.1 主要材料及试剂

砷剂雄黄（纯度≥99%，湖北信康医药化工有限公司，12279-90-2）。引物委托北京擎科生物科技有限公司合成；pCDH-puro 质粒由温州医科大学检验医学院生命科学学院实验室保存；Trizol Reagent（Life Technology，B610409-0100）；2×Phanta Max Master Mix（Vazyme，P525-01）；Plasmid Mini Kit（OMEGA，D6943-01）；Gel Extraction Kit（OMEGA，NA1111-1KT）。无缝克隆试剂盒[和元生物技术（上海）股份有限公司，M2026]；Lipo fectamineTM3000（Thermo Fisher，L3000015）；PML 抗体（ab96051）、P62 抗体（ab56416）、LC3B 抗体（ab192890）、p-mTOR 抗体（ab109268）、β-actin（ab8226）均购于abcam 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 HL-60 细胞由中国科学院上海细胞库提供，用含10% FBS 的IMDM 培养基培养。95D 和A549 细胞为实验室冻存细胞，分别用含10%的FBS的DMEM 和含10%的FBS 的1640 培养基培养。

1.2.2 质粒构建 根据NCBI 数据库及相关文献获得PML 与RARα 的mRNA 序列及其融合位点，设计引物。95D、A549 细胞用Trizol 法提取总RNA，拟转录为cDNA。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增目的基因，PML 正向引物：5’-AGAAGATTCTAGAGCTAGGCCACCATGGAGCCTGCACCCGCCCG-3’，反向引物：5’-GCTCTGGGTCTCAATGGTTGCCTCCCCGGCGCCACTG-3’。RARα 正向引物：5’-ACCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTT-3’，反向引物：5’-CGGATCCGATTTAAATTCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCGGGGAGTGGGTGGCCG-3’。产物以1%琼脂糖凝胶电泳后用Gel Extraction Kit 回收分别获得PML 与RARα 的片段。设计插入突变用的引物，PMLA216T正向引物：5’-TGCTCGTGCACGCTCCTTGAC-3’，反向引物：5’-AAGGAGCGTGCACGAGCAG-3’。以PML 的cDNA 为模板，用PML 正向和PMLA216T反向引物先进行1 次PCR 反应，再用PML 反向和PMLA216T正向引物进行第二次PCR 反应，将两次PCR 的产物用无缝克隆试剂盒按说明书行无缝克隆，即可获得PMLA216T片段，再将其与RARα、单酶切后得载体pCDH-puro 用无缝克隆连接即完成质粒构建。产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.2.3 脂质体转染 按说明书操作用LipofectamineTM3000 将pCDH-puro-PMLWT-RARα 和PMLA216T-RARα转染至HL-60 细胞，转染24 h 后开始相关实验。

1.2.4 血清饥饿和雄黄对PMLWT-RARα 和PMLA216TRARα 水平及自噬相关因子的影响 HL-60 细胞转染后，用不同浓度的雄黄处理24 h，收集细胞制样，Western blot 观察PML-RARα 和自噬相关因子的变化。细胞转染24 h 后用含0、5%、10% FBS 的IMDM培养基处理24 h，Western blot 观察PML-RARα 和自噬相关因子的变化。Western blot 步骤：浓缩胶80 V 30 min，分离胶120 V 60 min，转膜100 V 120 min，封闭1.5 h，一抗4℃孵育过夜，二抗孵育1 h，曝光显影。Western blot 结果用Image J 进行灰度值相对定量。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒测序结果

PMLWT-RARα 和PMLA216T-RARα 与已知序列完全符合，其中PMLA216T-RARα 的PML 部分的第216 个密码子所对应的3 个碱基由GCG 变成ACG，相应的氨基酸由丙氨酸（A）变为苏氨酸（T），突变点位测序结果见图1。

图1 质粒测序结果

2.2 不同浓度雄黄对PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα的影响

予0.5、1、2、4、8 μmol/L 雄黄处理24 h，结果显示：1、2、4、8 μmol/L 雄黄处理后PMLWT-RARα 和PMLA216TRARα 水平低于未经雄黄处理（0 μmol/L）的PMLWTRARα 和PMLA216T-RARα 水平，差异有统计学意义（P ＜0.05）；0.5 μmol/L 雄黄处理后PMLWT-RARα 水平低于未经雄黄处理的PMLWT-RARα 水平，差异有统计学意义（P ＜0.05）。相同浓度雄黄处理后PMLA216T-RARα水平高于PMLWT-RARα 水平，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 Western blot 检测不同浓度雄黄处理后对PMLWT-RARα和PMLA216T-RARα 的影响

2.3 血清饥饿对PMLA216T-RARα 水平及自噬相关因子的影响

5% FBS 和未经FBS 处理的PMLA216T-RARα、p-mTOR 水平低于10% FBS 处理的PMLA216T-RARα、p-mTOR 水平，p62、LC3B 水平高于10% FBS 处理的p62、LC3B 水平，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

图3 血清饥饿对PMLA216T-RARα 水平及自噬相关因子的影响

2.4 不同浓度雄黄对PMLA216T-RARα 水平及自噬相关因子的影响

予0、4、8、16、32、64 μmol/L 雄黄处理24 h，结果显 示：4、8、16、32、64 μmol/L 雄黄处理后PMLA216TRARα 水平低于未经雄黄处理的PMLA216T-RARα 水平，差异有统计学意义（P ＜0.05）；8、16、32、64 μmol/L雄黄处理后p-mTOR、p62 水平低于未经雄黄处理的p-mTOR、p62 水平，LC3B 水平高于未经雄黄处理的LC3B 水平，差异有统计学意义（P ＜0.05）；16 μmol/L雄黄处理后p-mTOR、p62 水平低于8 μmol/L 雄黄处理后的p-mTOR、p62 水平，LC3B 水平高于8 μmol/L雄黄处理后的LC3B 水平，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。

图4 不同浓度雄黄对PMLA216T-RARα 及自噬相关因子的影响

3 讨论

PML-RARα 蛋白会使白血病干细胞分化停滞、凋亡抵抗，进行持续自我更新发展为APL[8]。维甲酸和三氧化二砷通过靶向PML-RARα 使APL 从高度致死性疾病变成了高度可治愈的疾病[9-12]。以雄黄为主要成分的砷剂复方黄黛片在APL 治疗上被证明不劣于三氧化二砷，还具有口服方便、经济的特点[13-16]。近来临床上发现部分APL 患者砷剂耐药，该类患者的PML-RARα 中PML 部分发生了错义突变，如A216V、A216T、S214L、L217F、S220G 等，这改变了砷结合位点的结构导致耐药[4-7]。

p-mTOR 是自噬负调控因子，下调该因子会促进自噬。LC3B 参与自噬体的组装，其水平的高低或LC3B-Ⅰ/LC3B-Ⅱ的比例是检测自噬的通用指标。p62 是一种与信号转导、应激、自噬相关的蛋白，常在应激、自噬时升高，同时p62 是一种自噬接头蛋白，通过自身将底物和自噬囊泡上的LC3B 连接，并一起被消化降解，可用来区分非选择性或是选择性自噬[17-19]。

研究结果显示PMLA216T-RARα 对雄黄存在耐药。有研究显示自噬可以降解PMLWT-RARα[20]，通过血清饥饿可以使PMLA216T-RARα 水平下降，提示自噬可以降解突变的PMLA216T-RARα。雄黄浓度超过16 μmol/L后，PMLA216T-RARα 下降明显，伴有p-mTOR 水平下降和LC3B 水平升高，显示自噬增强，且p62 水平下降，提示增加药物浓度可以克服耐药，而16 μmol/L 及更高浓度的雄黄下调PMLA216T-RARα 水平可能是通过选择性自噬发挥作用的。此外，本研究注意到PMLA216TRARα 条带的上方有一陪行的条带，趋势和PMLA216TRARα 一致，推测可能是PMLA216T-RARα 的某种聚合体，有待于免疫荧光定位和免疫共沉淀等验证。

既往研究显示，相比正常成熟粒细胞，APL 细胞自噬相关蛋白低表达[21-22]，敲除自噬基因Atg7、Atg8后小鼠发生白血病[23]；用全反式维甲酸和三氧化二砷治疗APL 后，自噬相关通路激活，而阻断自噬会降低疗效[24-25]。结合本研究结果，我们认为自噬相关的因子是PML-RARα 错义突变相关耐药问题的潜在靶点，此外提高雄黄浓度也可以克服错义突变相关耐药，但如何在更低剂量情况做到这一点需要进一步研究。