参元益气活血胶囊对普纳替尼诱导的斑马鱼脑血栓的治疗作用

秦小妹 郭帅杰 李 悦 李思耐 刘卫红 王旭昀 刘红旭 周明学▲

1.首都医科大学附属北京中医医院，北京市中医研究所，北京 100010；2.首都医科大学附属北京中医医院中医男科，北京 100010；3.首都医科大学附属北京中医医院心血管科，北京 100010

脑血栓是常见的脑血管疾病，具有高发病率、高病死率、高致残率等特点，且临床预后差[1-2]。中医治疗脑血栓具有致残率低、急性期患者生存质量高、毒副作用小、治疗花费低等优点[3-4]。气虚血瘀是脑血栓急性期的主要病机[5-6]，参元益气活血胶囊（以下简称“参元丹胶囊”）是首都医科大学附属北京中医医院心血管科刘红旭主任研发的以益气逐瘀为治法的院内制剂，在临床用于治疗气虚血瘀型不稳定型心绞痛[7-8]。中医脑心同治理论认为，气虚血瘀是脑血栓和冠心病共同的病因病机，但该药用于治疗脑血栓的研究目前还未见相关报道。近年来，斑马鱼模型因其可视性强、观察方便、成本低和周期短等优势，在药理药效学研究中应用逐渐增多[9-11]。因此，为了给参元丹胶囊新的临床应用适应证提供实验学依据，本研究采用普纳替尼诱导斑马鱼脑血栓评价参元丹胶囊治疗脑血栓的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

黑色素等位基因突变型半透明Albino 品系斑马鱼，年龄为受精后2 d，共720 尾，以自然成对交配繁殖方式进行养殖，饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1 L 反渗透水中加入200 mg 速溶海盐，电导率为450～550 μS/cm；pH 为6.5～8.5；硬度为50～100 mg/L CaCO3）[12]，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC 认证的要求。

1.2 实验药物

参元丹胶囊（批号：Z20053327）由首都医科大学附属北京中医医院制剂室提供，按照临床等效剂量换算，用蒸馏水配制成20 mg/ml 母液；普纳替尼（批号：13771）购于美国MCE 公司，用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制成20 mg/ml 的母液；阿司匹林（批号：J1910024）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，用DMSO 配制成50 mg/ml 的母液。所有母液置于-20℃保存，按需稀释。

1.3 实验仪器和试剂

体式显微镜（SZX7，OLYMPUS）；六孔板（Nest Biotech）；96 孔板（NestBiotech）；精密电子天平[MS105DU/A，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，精密度0.01 mg]；行为分析仪（Zebra Lab 3.11，ViewPoint）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，Nikon）；吖啶橙染料（批号：494-38-2，Sigma）；甲基纤维素（批号：079K0054V，Sigma）；DMSO（批号：BCBZ1685，Sigma）。

1.4 脑血栓斑马鱼模型的建立

采用1.5 μg/ml 普纳替尼处理斑马鱼18 h，建立斑马鱼脑血栓模型[13]。在显微镜下观察，拍照，统计形成脑血栓的斑马鱼数目，并采用行为分析仪测定斑马鱼运动轨迹和速度，综合评价脑血栓斑马鱼模型建立与否。

1.5 实验分组与处理

1.5.1 药物对脑血栓斑马鱼的改善功效评价 选取180 尾斑马鱼置于六孔板中，每孔30 尾，容量为3 ml，分为6 组，正常对照组，模型组，阳性对照组，参元丹胶囊高、中、低剂量组，分别予养鱼用水，普纳替尼（1.5 μg/ml），普纳替尼（1.5 μg/ml）同时水溶给予阿司匹林（50 μg/ml）或参元丹胶囊（500.0、167.0、55.6 μg/ml）18 h 后，每组选取20 尾在显微镜下观察，统计形成脑血栓的斑马鱼数目，计算每组斑马鱼脑血栓的发生率。脑血栓发生率=斑马鱼脑血栓数目/斑马鱼数目[13]，记为I；脑血栓改善功效=I（模型组）-I（给药组）/I（模型组）×100%[13]。参元丹胶囊浓度确定依据：根据本课题组前期浓度摸索预实验结果，参元丹胶囊改善脑血栓功效最大耐受浓度为500 μg/ml，所以最终将参元丹胶囊实验浓度设置为55.6、167.0 和500.0 μg/ml。

1.5.2 药物对脑血栓斑马鱼的行为学改善功效评价选取180 尾斑马鱼置于六孔板中，每孔30 尾，分为6 组，具体分组及各组斑马鱼干预方法同“1.5.1”项下，每组选取20 尾斑马鱼应用行为分析仪测定斑马鱼运动速度（V）。药物对脑血栓的运动速度改善功效计算公式如下：运动速度改善功效=V（给药组）-V（模型组）/V（模型组）×100%[13]。

1.5.3 药物对脑血栓的斑马鱼血流速度改善功效评价选取180 尾斑马鱼置于六孔板中，每孔30 尾，分为6 组，具体分组和各组斑马鱼干预方法同“1.5.1”项下，每组选取20 尾斑马鱼置于心跳血流分析软件下录制斑马鱼血流视频，分析斑马鱼血流速度（S）。药物对脑血栓的血流速度改善功效计算公式如下：血流速度改善功效=S（给药组）－S（模型组）/S（模型组）×100%[13]。

1.5.4 药物对脑血栓的斑马鱼脑部细胞凋亡抑制功效评价 选取180 尾斑马鱼置于六孔板中，每孔30 尾，分为6 组，具体分组和各组斑马鱼干预方法同“1.5.1”项下，用吖啶橙进行染色，染色后每组选取20 尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，利用NIS-Elements D 3.10 高级图像处理软件进行图像分析并采集数据，统计斑马鱼脑部细胞凋亡数（N）。药物对脑血栓的脑部细胞凋亡抑制功效计算公式如下：脑部细胞凋亡抑制功效=N（模型组）-N（给药组）/N（模型组）×100%[13]。

1.6 统计学方法

采用SPSS 11.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnett’s t-检验；两组间比较采用t 检验。计数资料用例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验；多组率的两两比较采用Bonferroni方法校正。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼的改善功效评价

与正常对照组比较，模型组斑马鱼脑血栓发生率明显增加，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，参元丹胶囊低、中、高剂量组斑马鱼脑血栓发生率明显降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.017）。参元丹胶囊低、中、高剂量组斑马鱼脑血栓发生率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。参元丹胶囊高剂量组脑血栓改善功效为55%，参元丹胶囊中剂量组脑血栓改善功效为45%。见表1、图1。

表1 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼的改善功效评价（n=20）

图1 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼的影响（5.6×）

2.2 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼的行为学改善功效评价

与正常对照组比较，模型组斑马鱼运动速度明显降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，参元丹胶囊低、中、高剂量组斑马鱼运动速度明显提高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与参元丹胶囊低剂量组比较，参元丹胶囊中、高剂量组斑马鱼运动速度明显提高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。参元丹胶囊中剂量组运动速度改善功效为49%，参元丹胶囊高剂量组运动速度改善功效为47%。见表2、图2。

表2 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼的行为学改善功效评价（n=20）

图2 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼的行为学改善功效轨迹图

2.3 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼的血流速度改善功效评价

与正常对照组比较，模型组斑马鱼血流速度明显降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，参元丹胶囊中、高剂量组斑马鱼血流速度明显升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与参元丹胶囊低、中剂量组比较，参元丹胶囊高剂量组斑马鱼血流速度升高，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。参元丹胶囊高剂量组血流速度改善功效为32%。见表3。

表3 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼的血流速度改善功效评价（n=20）

2.4 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼脑部细胞凋亡抑制功效评价

与正常对照组比较，模型组斑马鱼脑部细胞凋亡数明显增加，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与模型组比较，参元丹胶囊高剂量组斑马鱼脑部细胞凋亡数明显降低，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。与参元丹胶囊低、中剂量组比较，参元丹胶囊高剂量组斑马鱼脑部细胞凋亡数明显降低，差异有统计学意义（P ＜0.01）。参元丹胶囊高剂量组斑马鱼脑部细胞凋亡抑制功效为67%。见表4、图3。

表4 参元丹胶囊对脑血栓斑马鱼脑部细胞凋亡抑制功效评价（n=20）

图3 参元丹胶囊处理后脑血栓斑马鱼脑细胞凋亡表型图（140x）

3 讨论

脑血栓是由于患者的脑部血液供应障碍使脑组织局部出现不可逆的损伤，导致脑组织出现缺血和缺氧，最终导致患者出现神经功能缺损[14-16]。气虚血瘀是脑血栓急性期的主要病机[17-18]，中医脑心同治理论认为，脑血栓和冠心病具有共同的中医病机——气虚血瘀[19-20]。参元丹胶囊由黄芪、水蛭、党参、土元等中药组成，临床用于治疗不稳定型心绞痛，有效率可达90.3%[21]。方中黄芪和水蛭为君药，配以党参和土元，佐以地龙、丹参等共同起到益气活血的功效。既往研究显示，参元丹胶囊可明显改善急性心肌梗死合并抑郁症大鼠的行为异常，提高海马神经递质生成，促进海马神经损伤修复[22]。因此，基于脑心同治理论和参元丹胶囊既往实验研究，推测参元丹胶囊有可能对脑血栓具有较好的治疗作用。

传统的哺乳动物脑血栓模型成本高、死亡率高、实验周期长，从而限制其在药理学中的应用。近年来，斑马鱼作为一种新的模式动物，因其成本低、可体外受精、可视性强、实验周期短，而被广泛用于评估药物疗效和安全性[23-25]。Zhu 等[13]报道，普纳替尼处理后的斑马鱼，建立缺血性脑卒中模型，可出现斑马鱼脑血管内皮损伤、脑血栓形成、血流量减少、运动能力下降，脑部细胞凋亡和炎症反应加重现象。与脑血栓患者的临床特征和病理较为相似，并且具有可视性强、实验成功率高、周期短等优势，更适用于脑血栓治疗药物的快速疗效评估和筛选实验。因此，本研究采用普纳替尼诱导的脑血栓斑马鱼模型评价参元丹胶囊对该病的治疗作用，为与实验体系保持一致，避免一些个体出现死亡，且有实验显示选取20 尾斑马鱼进行统计同30 尾结果无差异[26]，所以本研究将斑马鱼置于六孔板中，每组/每孔30 尾进行实验，每组选取20 尾进行统计。本研究结果显示，普纳替尼处理18 h 后的斑马鱼脑部出现明显的血栓表型，并伴随运动能力变差、运动速度降低、血流变慢和明显的脑部细胞凋亡。提示脑血栓斑马鱼模型是一个重复性好、操作简便且造模死亡率低的实验动物模型，值得推广应用。

本研究结果显示，参元丹胶囊可明显降低斑马鱼脑血栓的发生率，还可明显促进脑血栓斑马鱼的运动速度，改善其运动轨迹，此外，对脑血栓斑马鱼血流也有改善趋势。在上述研究基础上，本研究对其药理机制进行初步探讨，发现参元丹胶囊具有改善斑马鱼脑血栓的功效，可能与抑制斑马鱼脑部细胞凋亡有关。

综上所述，参元丹胶囊对普纳替尼诱发的脑血栓斑马鱼具有一定的改善作用，并且随着浓度增加，其改善作用更明显，与抑制斑马鱼脑部细胞凋亡有关。研究结果为拓展院内制剂临床应用新的适应证提供了实验学依据，但其具体的药理机制和具体干预环节还需深入研究。