基于网络药理学探讨染料木素治疗抑郁症的分子作用机制

胡燕珍 张媛媛 黄 斌 王亚敏 陈 乐▲ 杨 治

1.江西省中医药研究院中药研究所，江西南昌 330046；2.江西省儿童医院新生儿外科，江西南昌 330006

抑郁症是最常见的精神疾病之一，以生理、情感和认知障碍为主要特征，伴随的症状包括情绪低落、快感缺失、绝望、精力丧失、有自杀念头等[1]。世界卫生组织预测世界各地已超过3.5 亿人患有这种疾病，涉及各个年龄段[2]。同时，随着每年全球中老年女性的增多，围绝经期抑郁症的发病率呈逐年上升趋势。相关研究表明，在欧美围绝经期妇女中，轻度抑郁症的人占总人数的50%～60%，严重抑郁症占1%～3%[3]。围绝经期抑郁症的发生不仅影响中老年女性的生活质量，同时也给家庭和社会带来了沉重的负担[4]。现代研究认为，围绝经期抑郁症的发生与雌激素的缺乏有关[5]。其中，植物雌激素是一类存在于植物中具有雌激素生物活性的物质，其已作为临床绝经期妇女激素替代疗法的一种新选择。染料木素是植物雌激素的一种，其可选择性地与雌激素受体结合，表现出雌激素与抗雌激素活性。有研究报道，染料木素具有改善绝经后骨质疏松症妇女的生活质量和抑郁症状的能力[6]。但目前有关染料木素治疗围绝经期抑郁症的具体作用机制尚不明确。网络药理学的出现为染料木素治疗抑郁症的作用机制系统研究提供了新的思路和方法。网络药理学是一门以系统生物学理论为基础，采用生物系统网络分析方法，通过选取特定的信号节点对多靶点药物分子进行系统设计的新学科[7]。基于此，本研究采用网络药理学方法，分析和预测染料木素治疗抑郁症的分子作用机制，以期为揭示染料木素治疗抑郁症作用机制的科学内涵提供参考。

1 材料与方法

1.1 染料木素作用靶点预测

通过搜索下列数据库获得染料木素靶向蛋白编码基因的完整列表：中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）、比较毒理基因组学数据库（http://ctdbase.org/）、TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）。结果仅限于“homo Sapiens”。

1.2 抑郁症相关靶点预测

检索GeneCards（https://www.genecards.org/）和Home-NCBI-Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）数据库获得潜在抑郁症相关靶点，关键词输入“depression”，设置物种为“homo Sapiens”。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络图的构建

将染料木素作用靶点与抑郁症相关靶点的交集部分导入STRING 数据库（https://stringdb.org/），设置物种为“homo Sapiens”，获取药物-疾病靶点PPI 网络关系数据，将处理后的数据导入Cytoscape Version 3.6.1软件，绘制PPI 网络图，对生成的网络图进行拓扑分析，节点大小与degree 值呈正相关，并根据degree 值筛选出核心靶点。

1.4 “成分-靶标-疾病”网络构建与分析

将染料木素化合物、抗抑郁相关作用靶点和疾病导入Cytoscape Version 3.6.1 软件，构建“成分-靶标-疾病”网络图。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

使用DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）将染料木素抗抑郁症潜在靶点进行系统分析，设置列表和背景的限定物种为“homo Sapiens”，以P ＜0.05 进行关键靶基因GO 与KEGG 功能富集分析，并将结果以条形图形式输出。分析染料木素抗抑郁症的生物学过程、细胞成分、分子功能和信号通路。

2 结果

2.1 染料木素抗抑郁靶点预测

检索TCMSP、比较毒理基因组学、TTD 等数据库，删除重复数据，整理得到231 个染料木素的作用靶点。对Home-NCBI-Gene 和GeneCards 数据库检索结果进行整理，得到抑郁症相关靶点537 个。将染料木素作用靶点与抑郁症靶点相匹配，整理得到23 个染料木素抗抑郁症潜在靶点。见表1。

表1 染料木素抗抑郁潜在靶点

2.2 PPI 网络构建与分析

将23 个潜在靶点录入STRING 数据库，获取靶点PPI的网络关系数据，将其导入Cytoscape Version 3.6.1软件，绘制PPI 网络图（图1）。图中节点代表靶蛋白，节点的大小和颜色表示degree 值的大小，节点越大、颜色越深对应的degree 值越大。图中有相互关联的蛋白以线连接，线条的粗细代表蛋白相互作用的强弱。图中共有23 个节点，平均节点度为15.6，179 条边，平均局部聚类系数为0.882。在PPI 关系中，MAPK1、PTGS2、MMP9、VEGFA、AKT1、TNF 等6 个靶点 的节点较大，推测这些蛋白可能是染料木素治疗抑郁症的关键靶点，在染料木素治疗抑郁症过程中发挥重要作用。

图1 蛋白质-蛋白质相互作用网络图

2.3 成分-靶点-疾病网络构建

将染料木素化合物、23 个潜在靶点及疾病分别导入Cytoscape Version 3.6.1 软件，构建“成分-靶点-疾病”网络图（图2）。在网络图中，中间靠下节点代表染料木素，靠上节点代表疾病抑郁症，外圈节点代表染料木素抗抑郁的潜在靶点，共23 个节点，作用靶点与活性成分和疾病的相互关联用边来表示。从图中可看出染料木素可以对应不同的靶点，充分显示染料木素抗抑郁具有多靶点的特性。

图2 “成分-靶点-疾病”网络图

2.4 GO 富集分析

将染料木素抗抑郁的23 个潜在靶点导入DAVID数据库，经R 语言运行后可获得33 条GO 富集功能（P ＜0.05）。其中26 个生物过程（图3A）主要与细胞分裂正调控、蛋白激酶B 信号转导、丝氨酸肽基磷酸化正调控、RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正负调控、免疫应答、MAP 激酶活性正调控、细胞增殖正调控、血糖稳态、血管生成、NF-κB 信号正调控等相关。3 个细胞成分（图3B）主要包括细胞外间隙、胞浆、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物。4 个分子功能（图3C）主要涉及细胞因子活性、序列特异性DNA 结合、白细胞介素-1受体结合、类固醇结合。图中黑色条代表基因个数，条越长表示该GO 条目富集的基因越多；灰色条代表P值，条越长代表P 值越小。

图3 GO 富集结果条形图

2.5 KEGG 通路富集分析

在KEGG 分析中，以P ＜0.05 为界共筛选出23 条信号通路（图4），依次为癌症信号通路、利什曼病、疟疾、乙肝、结核病、NF-κB 信号通路、阿米巴病、肾细胞瘤、前列腺癌、细胞因子受体相互作用信号通路、丙肝、MAPK 信号通路、黑色素瘤、趋化因子信号通路、黏着斑、移植物抗宿主病、子宫内膜瘤、结直肠癌、慢性粒细胞白血病、造血细胞谱系、癌症过程中的胆碱代谢通路、人体T 细胞白血病病毒Ⅰ型感染、卵母细胞减数分裂，提示染料木素可能通过作用以上多条通路达到治疗抑郁症的目的。图中黑色条代表基因个数，条越长代表该通路富集的基因越多；灰色条代表P 值，条越长代表P 值越小。

图4 KEGG 通路富集结果条形图

3 讨论

目前，现代医学多用西药来治疗围绝经期妇女抑郁症，西药能够快速的改善患者的症状体征，但存在毒副作用大、依从性差、中断治疗复发率高等诸多问题，极大地影响了其在临床中的应用。而中医药依据患者的病症类型进行辨证论治，治疗效果不低于西药，且安全性更高，更受患者欢迎。研究表明，绝经期抑郁症的发生发展与体内雌激素水平的降低密切相关[8]。其中，植物雌激素是从植物尤其是豆类植物中提取的可以替代雌激素的作用并同时防止雌激素不良反应的发生，给广大围绝经期女性追求健康、远离烦恼带来了新的希望。染料木素是植物雌激素的一种，已成为绝经期妇女激素替代疗法的一种新选择。因此，研究染料木素抗抑郁的作用机制具有重要意义。

本研究通过构建的PPI 网络图，发现染料木素可能通过调节MAPK1、PTGS2、MMP9、VEGFA、AKT1、TNF 等核心靶点达到治疗抑郁症的作用。MAPK1 参与细胞的自噬、增殖、迁移、侵袭和脂代谢等生物过程[9]，其参与抗抑郁的机制与内质网蛋白加工过程有关[10]。PTGS2 是前列腺素生物合成中的关键限速酶。前列腺素合成酶在抑郁症患者中显著下调[11]，提示前列腺素生物合成途径的异常与抑郁症的发生密切相关，其也可通过降低神经炎症反应发挥抗抑郁的作用[12]。MMP9 又称明胶酶B，可以高效降解Ⅳ型胶原，在血管重生、炎症反应等生物过程中起关键作用。近年研究表明，抑郁症与炎症应答系统的激活有关，是一种炎症疾病[13]。VEGFA 是PDGF/VEGF 生长因子家族的最主要成员之一，通常也被称之为VEGF，在血管发生和形成过程中起着主要的调控作用。VEGF 是内皮细胞和神经元的一种有效的特异性有丝分裂原和神经营养因子，是突触传递的调节剂[14]。研究表明VEGF在海马神经发生和抑郁病理生理学中起重要作用，抑制神经细胞中VEGF 受体2 的表达会损害海马依赖性突触可塑性和情感记忆的巩固[15]。AKT1 可通过PI3K 依赖的机制被胞外信号激活，在体内参与代谢、细胞增殖和存活、胰岛素信号转导及血管生成等多种生物学过程。AKT1 基因SNPrs3001371 多态性与重性抑郁障碍患者认知功能损伤存在一定的关联性；G/G基因型患者与G/A 和A/A 基因型患者比较，认知功能损害更严重[16]。TNF 基因编码的蛋白是一种多功能的促炎性细胞因子，分为TNF-α、TNF-β 两种。其中，TNF-α 在抑郁症的发生、发展及临床药理机制中发挥着重要作用[17]。抑郁症相关性的荟萃分析（meta 分析）显示，抑郁症患者血清TNF-α 水平明显高于健康人群[18]。同时，刘玉芝等[19]研究表明，TNF-α 基因rs1800629 多态性与首发抑郁症的易感性相关。

靶点KEGG 通路分析表明，染料木素抗抑郁症作用与癌症通路、免疫炎症反应通路（趋化因子信号通路、细胞因子-受体相互作用信号通路、NF-κB 信号通路）、细胞凋亡通路（MAPK 信号通路）、病毒感染等通路相关。其中，免疫炎症反应和细胞凋亡是抑郁症的重要发病机制。抑郁症患者的相应脑区存在炎症反应，而介导炎症反应的趋化因子在其中发挥着重要的作用。在LPS 诱导的抑郁动物模型中，大鼠前额皮质的趋化因子CXCL1 和CCL2 水平明显升高[20]。另外，在LPS 诱导的外周急性早期炎症动物模型中，Col1a1或Rgs5 亚型的PDGFRβ 细胞能够介导中枢神经系统中的CCL2 迅速高表达，进而导致中枢神经系统炎症反应[21]，从而诱发模型动物出现抑郁性症状。细胞因子与相应受体结合后，具有调节细胞生存和死亡的作用，如TNF-α 可使NF-κB 的抑制蛋白磷酸化、泛素化从而发生降解，并从NF-κB 脱离而激活NF-κB 转移到核内与特定的DNA 序列结合，启动或抑制基因的转录，从而影响细胞生存或死亡。最近陆梅娟等[22]研究表明，抑郁症患者血清NF-κB 水平升高，其表达量影响抑郁症的发病过程。在刘丽珠等[23]研究中，发现APS 可通过抑制NF-κB 信号通路的磷酸化反应，稳定模型动物脑海马CA1 区自发性动作电位和群峰电位电压，可显著改善大鼠脑卒中后抑郁行为。MAPK已被证实具有调节行为、学习、记忆等方面的作用，MAPK 信号通路包括：ERK1/2、ERK3/4、ERK5、p38、JNK/SAPK，其中ERK1/2 通路与抑郁症关系最为密切。覃斌等[24]通过构建慢性不可预知刺激抑郁模型来探讨氯胺酮抗抑郁的作用机制，发现氯胺酮可通过抑制ERK1/2、NF-κB 信号分子，抑制炎症反应，显著改善抑郁大鼠的行为学。张世娇等[25]发现逍遥合剂可上调产后抑郁大鼠下丘脑内ERK1/2 信号通路上的p-MEK1、MEK1 蛋白表达水平，改善大鼠产后抑郁症状。以上研究均提示，ERK1/2 通路与抑郁症发病机制密切相关。综上所述，染料木素可能通过上述多种信号通路来调节各种生理活动，从而到达治疗抑郁症的目的。

本研究采用网络药理学的方法，对染料木素抗抑郁症作用的靶点和机制进行了系统的预测和分析，共筛选出核心靶点6 个、GO 生物信息33 条及相关信号通路23 条，为后续深入研究染料木素抗抑郁的作用机制提供了新思路。但本研究未对关键靶蛋白进行分子对接验证，因此染料木素抗抑郁的具体作用机制还需进一步实验验证。