miR-145 对三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭及转移能力的影响

朱凌霄 张 兰 张雪鹏 李昊鑫

华北理工大学附属医院肿瘤外科，河北唐山 063000

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中一种难治性亚型，由于缺乏特异性受体，目前TNBC 主要采用传统的化疗和手术治疗，但预后较差，所以寻找新的治疗手段，尤其是靶向治疗是目前的研究热点[1-2]。微RNA（microRNA，miRNA）是强大的“基因调节剂”，其中miR-145 作为表达较为显著的一类抑癌基因，可抑制TNBC 的增殖、转移及侵袭[3-4]。本课题组前期发现，miR-145 通过调控解聚素-金属蛋白酶17（adisintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）可影响MCF-7 乳腺癌细胞的增殖和侵袭[5]。为进一步观察其在TNBC 中的作用，本研究在降低TNBC 细胞中miR-145 的表达水平后，通过测定和分析下游ADAM17 及与其密切相关的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）相关指标的变化后，观察其对TNBC 细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其作用机制，为TNBC 的靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

人TNBC MDA-MB-231 细胞株（CL-0150）购于武汉普诺赛生命科技有限公司；miR-145 无义序列（miR2N0000001-1-1）、miR-145 inhibitors（miR20000）以及引物（miR01101）均由广州锐博生物科技有限公司设计与合成；Leibovitz L-15 培养基（10-045-CVR）购于美国Corning 公司；胎牛血清（A0100-3210）购于德国Cegrogen 公司；实时聚合酶链反应试剂盒（RK21 203）购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；Lipofec tamine 2000 试剂（11668027）购于美国Invitrogen 公司；ADAM17（GTX101358）购于美国GeneTex 公司；EGFR抗体（ARG66204）购于上海Arigo 公司。

1.2 细胞培养及分组

使用L-15 完全培养基（含10%胎牛血清和1%双抗）培育本研究的目标细胞，MDA-MB-231 细胞置于37℃、无CO2的饱和湿度培养箱中培养，实验分为空白组（细胞无特殊处理）、miR-145 NC 组（转染miR-145 无义序列）、miR-145 inhibitors 组（转染miR-145 inhibitors）。转染后分析确定各组miR-145 的表达水平以及转染效率。

1.3 实时聚合酶链反应检测各组miR-145 和ADAM17、EGFR mRNA 的表达

细胞转染后继续在细胞培养箱中培养48 h，Trizol 法提取各组的总RNA，利用逆转录试剂盒（锐博生物，ZR102-2）合成cRNA。以U6 和β-actin 分别作为miR-145 和ADAM17、EGFR 的内参，进行PCR 扩增。在电脑上预先设置好反应需要的相关程序，并按顺序进行45 个循环，过程主要包括：预变性（95℃，10 min）、变性（95℃，10 s）、退火（56℃，25 s）、延伸（72℃，1 min）。反应完毕后收集各组数据，各组mRNA 的表达量用相对定量法表示。实验所需引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4 Western blot 检测各组ADAM17 及EGFR 蛋白的表达

不同处理组细胞转染48 h 后，提取各组细胞的总蛋白并测定蛋白浓度。配制SDS-PAGE 胶并进行凝胶电泳，而后进行电转以及封闭，置于一抗工作液中，4℃冰箱中孵育过夜。次日置于二抗工作液中孵育，凝胶成像仪对条带进行显像并分析光密度（optical density，OD）值。

1.5 CCK-8 法测定细胞增殖活性

不同处理组细胞转染成功后接种于96 孔板中培养，每组可设3 个复孔。分别在转染后24、48、72 h 时加入CCK-8 试剂，并检测各孔的OD 值（450 nm）并记录。

1.6 Transwell 实验检测各组细胞的侵袭能力

转染成功后的各组细胞培养24 h 后进行消化重悬，加入提前铺好Matrigel 基质胶的小室中（约5×105个细胞/孔）。同时Transwell 下室加入L-15 完全培养基，36 h 后对侵袭细胞进行固定以及着色。待其明显着色后在显微镜下进行计数，记录各组细胞的穿膜数目。

1.7 细胞划痕实验观察细胞的迁移能力

各组MDA-MB-231 细胞转染成功6 h 后，用100 μl 无菌枪头对三组细胞划3 条直线，此时记为划痕实验0 h，计时24 h，观察并记录转染后显微镜下细胞的形态以及分布。

1.8 统计学方法

使用SPSS 23.0 软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验。以P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Lipofectamine 2000 介导的miR-145 转染率比较

miR-145 inhibitors 组miR-145 表达量低于miR-145 NC 组，差异有统计学意义（P<0.05）；miR-145 NC组与空白组miR-145 表达量比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1。

图1 Lipofectamine 2000 介导的miR-145 转染率比较

2.2 各组MDA-MB-231 细胞增殖情况比较

空白组与miR-145 NC 组比较：转染后时间比较，差异有统计学意义（P <0.05），而组间、交互作用比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。进一步两两比较，组内比较：转染后72 h，空白组、miR-145 NC 组OD值均大于转染后24 h，差异有统计学意义（P ＜0.05）。组间比较：转染后24、48、72 h，miR-145 NC 组与空白组OD 值比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

miR-145 NC 组与miR-145 inhibitors 组比较：转染后时间、组间、交互作用比较，差异有统计学意义（P <0.05）。进一步两两比较，组内比较：转染后72 h，miR-145 inhibitors 组OD 值大于转染后24、48 h；差异有统计学意义（P ＜0.05）。组间比较：转染后72 h，miR-145 inhibitors 组OD 值大于miR-145 NC 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。转染后24、48 h，miR-145 inhibitors 组与miR-145 NC 组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 各组转染后不同时间点OD 值比较（，n=3）

表2 各组转染后不同时间点OD 值比较（，n=3）

注：空白组与miR-145 NC 组比较：F时间=1059.059，P时间＜0.001；F组间=0.442，P组间=0.543；F交互=5.109，P交互=0.087。miR-145 NC组与miR-145 inhibitors 组比较，F时间=281.070，P时间＜0.001；F组间=20.413，P组间=0.011；F交互=73.391，P交互=0.001。与本组转染后24 h比较，aP ＜0.05；与本组转染后48 h 比较，bP ＜0.05；与miR-145 NC 组同期比较，cP ＜0.05

2.3 各组细胞侵袭能力比较

miR-145 inhibitors 组跨膜细胞数多于miR-145 NC 组，差异有统计学意义（P<0.05）；miR-145 NC 组与空白组跨膜细胞数比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2～3。

图2 各组细胞的跨膜结果（200×）

图3 各组细胞侵袭能力比较（n=3）

2.4 各组细胞的迁移能力比较

miR-145 inhibitors 组划痕愈合率高于miR-145 NC 组，差异有统计学意义（P <0.05）；miR-145 NC 组与空白组细胞愈合率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图4～5。

图4 各组细胞的迁移情况（200×）

图5 各组划痕愈合率比较（n=3）

2.5 各组ADAM17、EGFR mRNA 的表达情况比较

miR-145 inhibitors 组ADAM17 mRNA 相对表达量高于miR-145 NC 组，差异有统计学意义（P<0.05）；miR-145 NC 组与空白组ADAM17 mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P >0.05）。miR-145 inhibitors 组 和miR-145 NC 组EGFR mRNA 的 相 对表达量比较，差异无统计学意义（P >0.05）；miR-145 NC组与空白组EGFR mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P >0.05）。见图6。

图6 各组ADAM17、EGFR mRNA 的表达情况比较（n=3）

2.6 各组ADAM17、EGFR 蛋白表达情况比较

miR-145 inhibitors 组ADAM17、EGFR 蛋白相对表达量高于miR-145 NC 组，差异有统计学意义（P <0.05）；miR-145 NC 组与空白组ADAM17、EGFR 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P >0.05）。见图7～8。

图7 Western blot 检测各组ADAM17、EGFR 蛋白条带

图8 各组ADAM17 和EGFR 的蛋白表达量比较（n=3）

3 讨论

临床上TNBC 生存率低，复发率高，早期容易发生转移且侵袭性较其他亚型强[6]。由于TNBC 特殊的生物学特性（多种受体表达明显缺陷），现有的分子靶向治疗并不能获得较好的临床效果。而目前主要采用传统的化疗和手术治疗方式在大约30%的TNBC 患者中可以有效地发挥作用，但许多患者对于上述治疗方式没有反应或只有部分反应，且最终以远处转移的形式复发，可以说目前临床上患者的预后及生存期仍然不甚理想，所以寻找TNBC 的治疗靶点迫在眉睫[7-8]。已有研究证明，在miRNA 家族中存在很多与肿瘤发生发展息息相关的miRNA，他们通过与目标mRNA 结合并激发原癌基因或者抑癌基因的表达，参与了肿瘤的发生发展乃至预后的过程，即有的miRNA 促进肿瘤的增殖与侵袭，而有的miRNA 则参与负向调控肿瘤的生物学进程[9-10]。众所周知，miR-145 作为抑癌效果显著的miRNAs 之一，已经被证明与许多恶性肿瘤的病理进程有紧密的联系，比如在甲状腺恶性肿瘤中，miR-145 主要是靶向抑制PI3K/AKT3 信号通路，从而抑制甲状腺癌细胞的多种生物学特性[11]。当然，miR-145 靶向调控不同的信号通路来影响恶性肿瘤细胞增殖、侵袭等生物学行为的这一特性在胃癌、结直肠癌等疾病中亦有显著表现[12-13]。所以miR-145 有可能作为乳腺癌的治疗靶点[14]。本课题组前期研究证实，miR-145 过表达抑制MCF-7 乳腺癌细胞的增殖及侵袭[15-16]。我们进一步研究抑制miR-145 的表达对TNBC 细胞的影响，主要应用增殖实验（CCK-8 实验）以及Transwell 实验和细胞划痕实验证明miR-145 在TNBC 细胞中表达明显受到抑制时，可以有效促进细胞的生长增殖以及侵袭和迁移能力。

本实验还探究了miR-145 在TNBC 中可能存在的作用机制，通过分别检测ADAM17 和EGFR 在细胞中的表达变化，发现ADAM17 mRNA 和蛋白质水平均上调；而EGFR mRNA 水平无变化，但蛋白表达水平上调。提示miR-145 可能直接调控ADAM17，但不直接调控EGFR。查阅文献发现，在许多恶性肿瘤的发生发展过程中，miR-145 均可通过靶向调控ADAM17 来参与病理进程[17-18]。前期研究发现，miR-145 与ADAM17 存在碱基互补序列，这一信息主要来源于生物学信息库（TargetScan、PicTar 及miRanda），并据此预测了二者的关联性[16]。提示miR-145 靶向调控ADAM17 的信号通路在TNBC 中存在合理性。研究显示，EGFR 在恶性肿瘤发生发展的信号通路中，是通过被上游的ADAM17 锚定以及激活后，经历自身的二聚化以及磷酸化的过程，进而继续激活下游的差异信号通路，从而调控多种肿瘤发生机制[19-20]。本研究中EGFR 蛋白水平上调，可能是因为ADAM17 上调，其作为下游，蛋白表达亦升高，查阅相关文献亦支持这一结论[21]。

综上，miR-145 inhibitor 通过靶向激活ADAM17/EGFR 通路，促进TNBC 细胞的增殖、侵袭和迁移。这可能为未来TNBC 的临床治疗提供新的分子靶点和治疗思路。