现阶段草莓茎尖组织培养防褐化分析

潘忠强，尹 涛，邵 阳，焦功强

（青岛市农业科学研究院，山东青岛 266100）

0 引言

草莓肉含有蛋白质、糖、果胶等营养成分，其维生素C含量高于苹果、葡萄等水果。除新鲜食品外，草莓还可以加工成罐头、果酱、果酒、饮料等产品。接种培养材料后的组织培养过程中，由于机械损伤，酚类化合物从伤口流出。晒黑后逐渐扩散到培养基中，导致细胞中酶活性的增长，从而影响细胞的代谢工作。在组织培养中，它伤害了整个组织，导致组织死亡。草莓栽培过程中，要做好防止草莓茎尖组织培养褐变的工作。

1 相关试验材料以及方式

1.1 选取的试验材料

选择生长较好的红颜母株进行试验，母株上新长的匍匐茎顶端长度为：3～4 cm为此试验材料。

1.2 相关试验处理

1.2.1 外植物体的处理工作。检验材料浸在自来水中30 min，用洗涤剂处理，用自来水冲洗30 min，用无菌水冲洗3次，然后送到清洁工作台消毒。

1.2.2 培养茎尖工作。嫩叶在解剖显微镜下从外面一层一层地被剥掉，直到显露出半圆球形顶端分生组织。选取大小为0.3～0.4 mm的茎尖被切割，接种成三角形瓶（50 mL），从诱导中心灌满进行培养，每瓶接种四个茎尖。为解决草莓早期诱导培养中的褐变问题，介绍了几种抗褐变措施。上一次测试完成并进行统计分析后，开始下一次测试。每次接种练习10瓶，重复三次。栽培条件阳光光照为1500～2000 Lx，每天12 h，温度16～22℃。

1.2.3 继代增殖培养。浅绿色愈伤组织出现后，在ms+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L laa+agar10 g/L+30 g/L培养基中接种诱导培养。15～20天后，分化形成的不定芽首次发芽，同时根据草莓继代增殖培养工作中出现的玻璃化问题进行研究，从第一次培养开始进行分析。

此试验，对不同浓度的6-BA培养基进行设置，从而将培养基基础的成分分为以下几种：MS+琼脂10 g/L+蔗糖30 g/L，培养的时间平均分为25～30天。同时柱形组织培养瓶分为三个，选择350 mL，均透气的瓶子，进行接种工作，接种三个不定芽，每个接种十瓶，接种三次，培养的首要条件为1500～2000 Lx，12 h/天，培养的相关温度为16～22℃。

1.2.4 培养诱导生根。对继代培养工作中，整体的植物株体进行接种，选取株体高度为2 cm的试管苗进行诱导生根，培养基选取1/2MS。在15～20天之后，试管苗根生长到2 cm以上，生根数达到2根以上，苗株高达5 cm时，进行移栽。

1.3 相关测试方式以及指标

1.3.1 茎尖诱导培养试验。此外，接种工作后，应对茎尖表面进行检验，如全部变为褐色，则认定该茎尖出现褐化现象。接种工作结束后，如茎尖出现膨大愈伤组织等现象，应认定茎尖诱导后发生萌发现象。

褐化率以及萌发率应按照相关公式进行计算，如褐化率=∑（每瓶褐化茎尖数/每瓶茎尖数）每重复瓶数×100%，萌发率=∑（每瓶萌发茎尖数/每瓶茎尖数）每重复瓶数×100%。

1.3.2 培养继代增殖试验工作。培养继代增殖试验工作中，根据不同浓度的6-BA续代，对培养基试验进行三次培养，对不定芽进行接种，在30天后，对玻璃化以及增殖系数进行数据统计。此外，对试管苗的表现进行观察，如试管苗出现透明或半透明现象，或试管苗发生易碎，组织结构畸形等现象，则认定为玻璃化现象。

1.4 相关试验数据分析

Excel 2007用于相关测试数据的分析，SAS9.0软件用于统计分析。成员函数数据用于计算每个测试。会员函数的相关计算公式为R（X）i=（Xi-Xmin）/Xmax-Xmin。反向成员函数计算公式为R（X）i=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin），其中Xi表示每个测试索引的适应性，每个索引转换以实现平均值，对防褐化以及玻璃化效果进行评价分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度

6-BA处理对褐变的影响相比，添加6-BA（p＜0.05）可以显着提高发芽率，抑制茎尖的发芽率（p＜0.05），但随着6-BA处理浓度的增加，茎尖的发芽率和发芽率不会上升或下降。在所有处理中，A2的发芽率最高，其次是A3，但二者之间没有显著差异。成员功能分析表明A2的发芽率最高。

CK的晒黑率最高，为91.05%，A3为最低。并非所有效果都能通过评估发芽率或晒黑速度得到很好的反映。只有评估这两个指数，我们才能准确反映不同治疗方法的差异。

2.2 对于黑暗的预处理工作以及Vc对茎尖防褐化分析

黑暗预处理中，褐化率呈现出下降趋势，此外与CK进行比较分析，两组差异不明显，不具备可比性意义。

黑暗预处理工作中，处理工作达到2天时，萌发率呈现出升高趋势，但是两组之间的差异性还是不显著。

此外，添加V c 后，发芽率也逐渐提高，两组（p＜0.05）相当，褐色率显著下降（P＜0.05）。B5的发芽率最高，褐色率最低。B5和B6治疗没有显著差异。经过计算和充分分析，B5的总体评价值最高，其次是B6。

2.3 不同浓度

比较了6-BA对草莓芽玻璃的影响。第一次培养后，CK的增殖因子明显高于其他方法（p＜0.05）。随着6-BA浓度的降低，随机芽增殖系数下降，一些随机芽在CK中结冰。

第二种培养后，随机芽C1的乘法系数最高，为6.75，但与CK无显着差异。培养后，每次治疗的随机芽显示出不同程度的玻璃，但玻璃率明显低于CK（p＜0.05）。

按照第三次培养模式，芽增殖不定系数和单个处理的玻璃化率明显低于CK（p＜0.05），芽增殖不定系数随浓度下降6-BA呈下降趋势，根据成员功能，C1在第一次、第二次和第三次培养中的总值最高。

合成了第一、第二、第三培养中不定芽的增殖系数和玻璃化率，并对平均值进行了比较分析。发现CK中不定芽的倍增系数最高，为6.30，其次是C1，但C1和CK之间没有显着差异。6-BA浓度降低，不定芽的玻璃化率显着降低，C3的最低值仅为14.14%。此外，还发现具有成员资格函数的C1总值最高。

2.4 培养生长以及褐化、玻璃化

当前，通过茎尖组织培养进行无病毒苗培育，是市面上快速繁殖草莓以及无毒苗的主要方式。本研究结果显示，草莓剥去茎尖接种培养方式，大致咋3～7天内就会出现愈伤组织，然而咋在20～25天后，愈伤组织一般会变为浅绿色，在培养35～40天后会形成不定芽，然后在30天内进行继代组织培养，从而形成完整的植株，植株高达两厘米，进行诱导生根，20天内进行移栽。

3 结语

相关研究表明，褐变主要由苯酚氧化形成，在多酚氧化酶作用下形成喹诺酮。在组织培养中添加抗氧化剂或吸附剂可以防止喹诺酮的形成。Vc作为抗褐变剂也广泛应用于植物组织培养中。通过过滤过滤将Vc添加到培养基中可以大大降低铣削茎尖的褐变率，但操作需要大量时间和劳力。但是，采用VC解决方案浸泡草莓跑步者的端盖比较容易。Vc溶液浓度为300 mg/L时，发现能显着降低茎尖的褐变率，从而促进外来愈伤组织，并能显着提高发芽率。

Vc浸渍时间达到9 min后，褐变与控制相比明显下降，表明褐变只有在一定时间内浸入Vc溶液后才能停止。此外，在培养基中间添加PVP抗氧化剂可以大大降低草莓茎尖的褐变率，也可以促进愈伤组织，发芽率最高可达100%。但加入活性炭吸附对褐变没有明显影响。

综上所述，将草莓芽浸泡在Vc溶液中，在培养基中间加入抗氧化PVP，可以大大抑制草莓茎尖的褐变，促进草莓茎尖的愈伤组织萌发。