临床骨感染诊断中宏基因组测序的应用及发展

李京元，张红星，陈宇飞，彭 页，杜俊杰

骨感染是骨科临床中极具破坏性且难以治疗的并发症，在临床骨科各专业中均常见，而且治疗费用昂贵。2018年国际共识会议的研究组统计了北美骨科所有亚专科感染发生率为0.1%～30.0%，而每位患者为此花费的医疗费用为1.7～15.0万美元[1]。骨感染的危害巨大，可以形成难以根治的慢性骨髓炎，导致长期住院和多次翻修手术以至于导致内植物失败，甚至截肢等，从而产生高昂的治疗费用，增加社会医疗负担。对骨感染来说，准确、快速的病原学诊断以制定适当的抗生素治疗方案，对缩短感染病程乃至增加治愈率至关重要。微生物培养法一直是骨感染诊断的“金标准”，样本容量大、成本低和易于学习等优点使其在临床中广泛应用。然而由于细菌生物膜等原因，其检测结果敏感性低且诊断速度慢，在一些厌氧及苛氧菌感染中还需要特定的培养技术。尤其在低毒性感染、特殊病原体感染或取样前应用抗生素的情况下，甚至可能出现假阴性的结果。在进行骨感染病原学鉴定时，传统微生物培养法的缺点尤为突出，在缺乏病原学诊断指导的情况下，临床医生只能进行经验性应用广谱抗生素，常常使患者未能得到及时、有效的治疗，导致其预后不良。随着分子诊断方法不断兴起，以PCR为基础的分子诊断技术解决了上述部分病原体鉴定的问题。16S rRNA靶向测序是应用高通量技术对细菌具有高度保守性和特异性的基因序列进行测序，可以对病原菌进行微量、快速且准确的鉴定。然而这些方法的敏感性尚有争议，其次，16S rRNA基因测序是专门针对细菌的检测方法，不能检测到真菌或病毒，而且对于细菌种水平鉴定的准确性通常没有属水平可靠[2]。而且难以发现未知病原体的存在，无法根据病原体的核酸序列设计引物，成为这类技术存在的最大缺陷[3]。近年来，将宏基因组高通量测序法（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）用于感染性疾病的诊断是一个活跃的研究领域。这一方法可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，而不依赖于传统的微生物培养，能够快速、客观的检测临床样本中的多种病原微生物（包括病毒、细菌、真菌、寄生虫），尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断，对于骨科临床中感染性疾病的诊断具有广阔的应用前景。笔者将对宏基因组测序法的原理，在骨感染诊断中的优势和应用现状，以及发展方向进行综述。

1 宏基因组测序方法的原理

宏基因组是指特定环境中全部生物(微生物)遗传物质DNA的总和。mNGS是利用新一代高通量测序技术（next-generation sequencing，NGS）检测临床样品中全部微生物的基因组DNA，然后将其与参考基因组数据库进行比较以鉴定病原体。与传统培养法相比，其无偏倚、快速、全面、准确等特点尤为突出[4]。

2 mNGS临床感染性疾病应用

随着mNGS 技术平台的完善和临床研究的增多，mNGS在临床中感染性疾病的诊断中的运用越来越广泛。2014年，有研究报道了世界首例通过mNGS诊断的中枢神经系统感染病例[5]，患者因头痛和发热在8个月中反复入院治疗，尝试了包括培养和活检在内的多种检验方法仍然无法明确其致病病原体，患者随后进入了昏迷状态，最终使用mNGS对患者脑脊液样本进行检测，明确为钩端螺旋体感染，随后的针对性青霉素治疗使患者痊愈出院。显示了mNGS在临床感染性疾病诊断中的优势，奠定了mNGS在临床感染性疾病诊断中的应用基础。2019年同一个研究组发表了临床宏基因组病原学诊断的系统性、多中心研究[6]，应用mNGS对脑脊液进行检测，比传统方法检测到更多的潜在病原体。其结果表明mNGS方法在脑膜脑炎的临床诊断中是一个具有潜力的方法，在神经侵袭性感染的早期诊断和治疗中具有重要的指导意义，同时可以识别新发感染和疾病的表型。通过对临床样品直接测序而去除培养步骤，可以进一步减少诊断所需时间，并且可以检测到通过常规方法未能鉴定到的病原体。因此作为临床中诊断检测的一个组成部分，对临床标本直接进行宏基因组测序具有重要的临床价值。

3 mNGS在骨感染诊断中的优势

3.1 敏感性高 细菌种群的多样性可能是骨感染治疗成功率低的原因之一[7]。目前，对骨感染细菌的多样性以及厌氧和苛氧微生物对这些感染的作用知之甚少。从理论上讲，只要拥有足够长的测序长度、对微生物基因组的多次测序以及良好的参考数据库，几乎所有微生物都可以被准确地识别[8]，因此其可以广泛地识别已知的常见病原体和对未预料到的罕见病原体进行菌株鉴定[9]，甚至发现新的微生物[10]。

mNGS在骨感染中对培养阴性的病例诊断具有特别的优势。传统微生物培养法诊断的敏感性低，假阴性问题严重。培养阴性是指临床上有明确感染征象，而传统培养方法结果阴性的病例。假阴性的原因可能是病原体为不易培养的苛氧菌，或存在需要更长培养时间的病原菌，或术前进行过抗生素治疗等。研究发现，在脊柱椎间盘感染中只有43%～78%的病例的活检培养阳性[11]，在化脓性关节炎中淋球菌性关节炎的培养敏感性仅为50%[12]。一篇前瞻性研究中假体周围感染（periprosthetic joint infection，PJI）常规组织培养的敏感性为55.73%[13]。也有研究认为，关节置换假体周围感染培养假阴性的发生率估计高达25%[14]。24%～68%的急性血源性骨髓炎（AHO）和21%～70%的脓毒性关节炎培养阴性[15-16]。Thoendel等[17]报道了应用mNGS在PJI诊断中的大样本量研究。在细菌培养阳性的患者中，应用mNGS方法94.8%(109/115)的病例能够检测出已知病原体，9.6%(11/115)的病例检测出了其他潜在的致病微生物。在98 例细菌培养阴性的PJI患者中，43例（43.9%）发现了新的潜在的致病微生物。假阴性常常困扰临床医生，使抗生素治疗缺乏针对性，而经验性的广谱抗生素的应用会增加抗生素相关不良反应和并发症的风险，以及促进耐药感染的发生。2019年Sigmund等[18]发表的一篇特殊病例报道中，一位慢性PJI女性患者在常规培养及16S rRNA基因PCR检测结果均为阴性的情况下，应用mNGS检测出P. micra（微小微单胞菌）的感染，是一种存在于人类口腔和胃肠道的常见的共生专性厌氧球菌。在应用针对性的抗生素治疗后症状明显好转，成功避免了二期的翻修手术。因此，mNGS可以有效的避免假阴性的发生，有助于提高细菌学诊断率，使抗生素的应用更具针对性，改善临床治疗效果。

3.2 检测速度快 mNGS技术直接对临床样本进行测序分析，不依赖微生物的培养，使检测时间大大缩短，从而使得患者可以尽早选用针对性的抗生素进行治疗。培养法通常包括采样、培养、种属特异性识别、药敏试验等步骤，所需时间从3～14 d不等，而mNGS技术一般可在24 h内给出结果。有文献指出在化脓性关节炎、骨髓炎及骨折相关感染的诊断中，感染部位样本的微生物培养时间应至少为10 d，高毒力的病原体(如金黄色葡萄球菌)可在1～2 d内培养，但低毒力病原体的培养可能需要长达14 d，分枝杆菌所需时间更长，同时如果怀疑存在特殊病原菌感染时，还需通知实验室应用特定的培养技术[18]。2016年Abril等[19]采用mNGS技术对1例60岁男性脓毒血症患者的血浆进行宏基因组测序，在24 h之内给出了嗜二氧化碳噬细胞菌感染的诊断，迅速且准确。说明mNGS在病原诊断的特异性及速度方面明显优于传统方法。对骨感染中病原菌进行更加准确、快速的诊断，将为定向治疗提供新的见解，并可能改善临床预后。

3.3 耐药信息 此外，mNGS可以在病原菌的耐药性预测方面给出快速准确的信息[19]。近年来由于抗菌药物的大量应用，导致细菌耐药性增强，耐药性细菌广泛传播，新型耐药菌不断出现。有报道指出，慢性化脓性骨髓炎所分离出的金黄色葡萄球菌对青霉素和氨苄西林表现出高度耐药性，耐药率在90.0%以上，对头孢噻肟和头孢唑林等第2代头孢类药物的耐药率在70.0%以上，因此常规临床用药不宜作为慢性化脓性骨髓炎的临床用药[20]。2013年，Koser等[21]通过mNGS方法明确了多重耐药肺结核分枝杆菌的耐药情况，得到了共39个耐药基因，包括了在标准化实验室中报告的9种药物耐药，同时后期的表型实验证实了基因组数据的准确性。因此，借助mNGS技术，可以更加完整、快速、准确地了解临床微生物的耐药情况，为临床病原学诊断提供依据，为临床中治疗药物的选择提供重要的支持[22]。

3.4 混合感染 mNGS可以提供关于样品中微生物浓度的定量或半定量数据，在混合性感染疾病的诊断方面表现了较大的潜力与优势。2019年Wang等[23]指出mNGS比传统检测方法具有更广泛的病原体检测范围，mNGS在混合肺部感染的诊断中是一项具有前途的技术，具有潜在的应用价值。

4 发展方向

4.1 进一步提高敏感性 由于临床样本采集复杂多样，临床标本中的大部分核酸来自宿主，这对病原学检测的敏感性造成了影响。在分析前阶段可以通过使用皂素或其他化学试剂选择性地溶解人类白细胞，然后用脱氧核糖核酸酶处理释放的人类基因组，从而使病原体微生物DNA相对富集，提高诊断的敏感性[24]。另一种不同的方法是应用离心等物理方法，去除与人类基因组物质相关的高分子量遗传内容。一些研究已经证明，应用此方法后病原体核酸相对富集[25]，有助于诊断。在测序阶段可以通过宿主损耗法降低mNGS数据中人类宿主背景序列的相对比例，从而提高病原体检测的分析灵敏度，可以部分改善检验结果[26]。

4.2 进一步提高特异性 随着基因库数量的增长，数据库不断更新，常见病原体的基因组数据是可用的，然而对于罕见的病原体，通常只有特定基因或有限区域基因组被测序，导致罕见病原体或新出现的病原体菌株的参考数据库不完整，严重限制了根据这些序列进行比对的检测准确性。因此，定期更新完善参考数据库尤为重要，添加新的病原体参考序列将提高mNGS检测的特异性。同时，新的参考序列应避免其他物种的相应序列的污染，减少假阳性的风险[27]。

4.3 规范操作流程 骨感染的活检也可能在样本采集时在无意中被污染，如细针穿刺过程中皮肤菌群的污染，但常见的污染物(如不动杆菌、链球菌、角质菌和葡萄球菌等)也是引发PJI的常见原因[28]，这使情况更加复杂，难以判断病原体来源，增加了诊断难度。微生物污染无处不在，可能存在于试剂、实验室环境[29]或正常的人类菌群中[30]。由于mNGS的敏感性，即使是微量的外部污染也会出现在测序数据中。因此，工作流程中的质量控制十分重要，以保证尽可能无菌和无核酸的实验环境。必要时可以使用阴性对照、试剂评估等方法，以确保实验室和样本的交叉污染不会产生假阳性结果[28]。

综上所述，mNGS是一项革命性的技术，它的出现在多个方面颠覆了骨感染的传统临床检测手段，使其成为一项未来潜在的诊断方法。本综述阐述了这项新技术用于骨感染诊断的意义及可能性。虽然mNGS技术的出现令人兴奋，因为其检测速度快、准确率高、覆盖面广等优势，目前广泛应用于基础及临床研究当中，但其发展速度往往超过了临床试验的验证和临床证据的收集过程，要进入临床成为主要诊断技术仍需解决很多问题。与任何新技术一样，将mNGS技术应用于骨感染诊断，还需更多高质量研究作为支持，在与传统诊断方法结果的一致性等方面还需大样本、系统性的研究加以验证。随着mNGS技术成本的降低，操作流程的不断完善及简化，其定将成为骨感染诊断的重要组成部分。