5/6肾脏切除动物疾病模型的中医证候探索及扶正化瘀降浊通络方证测验*

陈紫薇， 陈 明， 何凯杰， 陈艳琼

(1.成都市中西医结合医院， 成都 610000；2.成都中医药大学附属医院， 成都 610000)

慢性肾衰竭(chronic renal failure, CRF)是多种原发和继发性肾脏病变持续进展的共同结果，严重危害人类健康和生命[1]。近年研究发现，中医药在延缓肾病进展方面疗效独特，但作用机制尚不明确，需深入探讨。动物模型是中医药机制研究的重要载体，5/6肾切除大鼠模型是通过手术方式减少有效肾单位，从而建立的一种CRF经典西医动物疾病模型[2]，但是中医药研究需要“病证结合”[3]，此模型是否能用于中医药机制研究，值得进一步探讨。

有人发现，机体细胞免疫功能(CD4+T细胞、CD8+T细胞)的变化与中医“正虚证”密切相关[4-6]，而C反应蛋白(c reactive protein，CRP)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-1β、IL-6等微炎症状态指标，被认为是机体“邪实证”的重要物质学基础[6-8]。同时中医认为CRF病程长，病势缠绵难愈，多见“虚实夹杂证”。本研究拟从宏观方向(大鼠一般情况)和微观方向(细胞免疫功能和微炎症状态指标)研究5/6肾切除大鼠的中医证候变化，同时通过“以方测证”[9]，使用前期临床研究对CRF疗效确切的经验方——扶正化瘀降浊通络方干预5/6肾切除大鼠，进一步探讨其中医证候，以期明晰此模型是否能够作为中医药机制研究的理想模型，为CRF“正虚邪实证”的中医药研究提供载体。本研究已通过成都中医药大学附属医院实验动物伦理委员会审查,批准号SCEC2019-051-01。

1 材料

1.1 动物

SPF级别雄性SD大鼠54只，体质量(190±20) g，购自成都达硕实验动物有限公司，动物许可证号scxk(川)2015-030。饲养环境温度(25±2) ℃，相对湿度50%～70%，自由进食与饮水。

1.2 主要试剂与仪器

Anti-rat CD4抗体、Anti-rat CD8a抗体(Bio Legend 公司，货号分别为201511、200607)；CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒(Becton Dickinson公司，货号分别为7172720、P150695、P150683、P149504)。

全自动生化分析仪(Siemens公司，型号ADVIA2400)；流式细胞仪(BD公司，型号FACSAria III)；酶标分析仪(TECAN公司,型号sunrise)；台式离心机(江苏湘仪公司，型号L500)；洗板机(SYM-Bio Life Science公司, 型号Egate2310)。

1.3 药物

扶正化瘀降浊通络方组成：黄芪(批号1702001)、熟地黄(批号1704098)、甘草(批号1607078)、丹参(批号1610049)、红花(批号1704094)、土鳖虫(批号1604061)、酒水蛭(批号1612015)、酒黄芩(批号1609043)、酒大黄(批号170107)，均购于成都中医药大学附属医院的中药房，按照传统中药煎煮方法制备用于灌胃的中药水煎剂，浓缩煎剂至5.24 g/mL(含扶正化瘀降浊通络方生药)备用。

2 方法

2.1 动物分组、模型制备及给药

将SD大鼠随机分成假手术组、模型组、中药组各18只。模型组、中药组动物适应性饲养1周后进行造模手术，造模前禁食不禁水，给予2%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉，开腹暴露左肾，切除肾脏的上下极及外侧(共2/3肾脏组织)，1周后行右肾全切术，完成5/6肾切除手术造模，术后恢复1周后进入药物干预治疗阶段。假手术组同期给予开腹手术，仅暴露肾脏不行肾脏切除，饲养方法同模型组。各组大鼠术后均未出现手术切口感染，未行抗生素预防性抗感染处理。造模成功后，给药剂量按临床实验方法学计算，给予扶正化瘀降浊通络方水煎液39.3 g/kg体质量灌胃，每日1次。模型组和假手术组给予等量清洁饮用水灌胃。

2.2 标本采集

灌胃后4周、8周、12周分别处死一批大鼠，每组每阶段处死6只。末次给药后将大鼠置于代谢笼中，禁食不禁水，24 h后给予2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取全血1 mL留作流式细胞仪T细胞亚群检测，取全血2 mL离心后分离血清，用于生化及CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA检测。

2.3 观察指标与检测方法

2.3.1 大鼠一般情况观察 动态记录各组动物的精神状态、活动状态、毛发光泽度、目色、舌色、四肢情况、饮水量、二便及体质量变化。

2.3.2 生化指标检测 采用全自动生化分析仪酶法检测血肌酐和尿素氮水平。

2.3.3 全血T细胞亚群检测 运用流式细胞术检测全血T细胞亚群CD4+(%)、CD8+(%)，具体按试剂盒步骤操作。

2.3.4 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6微炎症指标检测 采用ELISA法检测血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6含量，具体按试剂盒步骤操作。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况变化

与假手术组比较，模型组的行为状态自8周出现异常，表现为精神萎靡，喜互相抱团；外观出现改变，可见毛色变黄、无光泽、竖起、杂乱无章，目色、耳色变淡，尿量增加，部分可见尿液浑浊；12周时活动度明显下降，外观可见毛色枯黄，部分大鼠自行撕咬皮毛、局部毛发斑驳、舌色紫黯、四肢肿胀等，尿量减少，大便出现干结。中药组8周时也呈现精神萎靡，活动度下降，外观上毛发光泽度减弱，目色、耳色变淡，但较模型组好转，大便稀软不成形，12周时大鼠活动度与8周相似，尿量较模型组多，大便稀软不成型，至12周仍未见舌色紫黯且无四肢肿胀。

3.2 各组大鼠体质量变化

表1示，整个实验过程中大鼠体质量持续增长。与假手术组比较，模型组大鼠第8周体质量下降(P<0.05)，12周时明显下降(P<0.01)。与模型组比较，中药组第8周与第12周体质量均明显增长(P<0.05)。

3.3 各组大鼠血肌酐和尿素氮变化比较

表1示，与假手术组比较，模型组大鼠4周、8周、12周的血肌酐与尿素氮水平均显著升高(P<0.01)，中药组与模型组比较，4周、8周、12周的血肌酐水平显著下降(P<0.01)，但与尿素氮水平比较差异无统计学意义。

表1 各组大鼠体质量、血肌酐、尿素氮变化比较

3.4 各组大鼠CD4+T、CD8+T细胞比率变化

表2示，相较假手术组，模型组CD4+T细胞比率从第8周开始下降(P<0.05)，12周下降更加明显(P<0.01)，CD8+T细胞比率在8周、12周均有升高(P<0.01)。与模型组比较，中药组同期的CD4+T细胞比率有所升高，其中以12周升高明显(P<0.05)，表明中药可降低12周时CD8+T细胞比率(P<0.05)。

表2 各组大鼠CD4+、CD8+细胞比率变化比较

3.5 各组大鼠血清CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6变化

表3示，与假手术组比较，自4周起，模型组CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6均有明显升高(P<0.01)，且随病程延长逐渐上升。与模型组比较，中药组微炎症因子表达量均下降，其中CRP、IL-1β第8周、12周表达量均明显下降(P<0.01)，TNF-α、IL-6第12周时表达量明显下降(P<0.05，P<0.01)。

表3 各组大鼠血清CPR、TNF-α、IL-1β、IL-6变化比较

4 讨论

5/6肾切除模型是目前经典的CRF动物疾病模型[10]，主要采用手术方式造成有效肾单位减少，呈“三高”状态(高压力、高滤过、肾小球高灌注)，最终形成以肾小球硬化、肾小管萎缩、肾间质纤维化为病理特点的动物疾病模型，并伴有血肌酐、尿素氮升高、肾小球的滤过率下降等实验室指标变化，与临床CRF疾病发展模式非常相似，同时具备造模方式单一、简便易行、稳定性与重复性好、干扰因素少等优势[11]。本研究动态检测CRF大鼠血肌酐、尿素氮情况发现，随着病情进展大鼠血肌酐和尿素氮水平持续增长，并通过计算大鼠的肾小球滤过率进行性下降，符合CRF的诊断标准，是一种成功的西医动物疾病模型。

中医尚无CRF的病名，大部分医家认为肾虚为其核心机制，常伴见肺脾心肝等多脏虚损，肾病日久，耗损正气，正气亏虚，推动无力，致气机阻滞，有形之邪渐长；气不行血，血不行常道，致血瘀脉络；阳虚可致气化不利，水湿停聚，络脉阻滞，逐渐出现病理产物等内邪积聚[12],故CRF本属“本虚标实”范畴[13]。动物基础研究无法通过传统的“望闻问切”对大鼠进行辨证，但从宏观水平观察，本实验中模型组大鼠出现精神萎靡、喜互相抱团、活动度下降等阳气衰弱表现。《素问·六节脏象论篇》曰：“肾者，……其华在发。”大鼠毛色变黄、皮毛无光泽、毛发竖起、杂乱无章，呈现肾虚表现；大鼠目色、耳色变淡，与脾虚不能运化、气血生化无源有关；后期大鼠出现自行撕咬皮毛，考虑与血虚风动所致；同时其舌色紫黯，考虑因阳气无力推动，体内瘀血阻滞；其四肢肿胀，出现大便干结，考虑因脾虚、水液代谢失司所致。可见CRF大鼠存在脾肾亏虚和浊瘀内阻证候，系典型的“正虚邪实证”。

研究表明，肝郁脾虚、肝肾阴虚、脾肾阳虚等以虚证为主要证型的患者体内CD4+/CD8+细胞比值显著低于正常[5]。使用百令胶囊等补肾健脾扶正类中药，可改善T细胞免疫失调情况，提高免疫能力[14]，故可通过检测细胞免疫功能指标(CD4+T细胞比率、CD8+T细胞比率)，反映动物正气强弱情况。本研究发现，CRF大鼠血肌酐升高的同时，其体内CD4+T细胞比率逐渐下降，CD8+T细胞比率逐渐增高，说明大鼠的免疫功能下降，从微观水平提示CRF大鼠有“正气亏虚”的微观中医证候。

研究发现，CRF患者因肾小球滤过率下降、自由基等氧化产物清除减少,氧化抗氧化系统失衡,促进了炎症反应,体内都存在以CRP明显升高和炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6等在正常范围内相对升高为特征的慢性炎症状态的炎症反应[15]。研究发现，湿浊证患者血清CRP升高的概率是非湿浊证的4.125倍，提示湿浊证患者CRP水平高于非湿浊证患者[16]。李小会等[17]发现，湿热证型患者TNF-α、IL-1β、IL-6含量显著高于脾肾阳虚证组。李媛等[18]发现，使用健脾除湿药物可使患者体内血清CRP、TNF-α、IL-6水平明显降低，全身炎症状态得到改善，故可将微炎症状态看作是CRF“邪实证”的微观体现[19]。本研究发现，4周时微炎症指标出现一个小高峰，考虑与术后炎性反应所致。从整体12周观察来看，CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症指标进行性增高，说明CRF大鼠存在微炎症状态，提示该模型大鼠呈现“邪实证”微观中医证候。

为进一步明晰该CRF大鼠的中医证候特征，本研究运用“以方测证”原理[9]，使用临床治疗CRF“正虚邪实证”的有效验方扶正化瘀降浊通络方干预CRF大鼠。扶正化瘀降浊通络方组成：生黄芪、熟地黄、酒大黄、黄芩、丹参、红花、酒水蛭、土鳖虫、甘草，为CRF经典方(肾康方)和《金匮要略》经方(大黄虫丸)化裁而成，具有“通补并用，标本兼顾”之效，弥补了肾康方活血之力不足、大黄虫丸补虚之效欠佳等缺陷，取长补短是治疗慢性肾脏病“正虚邪实证”的基本方。本研究显示，使用扶正化瘀降浊通络方后大鼠仍精神萎靡，但活动度增加，说明阳气得到一定补充；大鼠外观较模型组状态好，说明使用补益脾肾药物后脾肾亏虚状态得到改善；舌色紫黯情况不明显，说明给予活血通络药物后体内瘀血阻滞情况有所好转。从宏观层面观察，使用扶正化瘀降浊通络方可使CRF“正虚邪实”情况得到改善。从微观水平分析，扶正化瘀降浊通络方治疗后大鼠体内CD4+T细胞比率下降幅度减缓，CD8+T细胞比率增高幅度变慢，提示大鼠的“正虚证”情况有所改善，同时运用此方还使CRF大鼠体内CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6等微炎症指标增幅减缓，证实CRF大鼠“邪实证”情况好转，具有“祛邪”功效，基于“以方测证”原理，可见该模型符合“正虚邪实证”。

综上所述，5/6肾切除模型是一个经典的CRF疾病模型，同时存在免疫异常和微炎症状态。通过宏观及微观水平研究证实，其符合“正虚邪实证”，可作为进行中医药治疗具有“正虚邪实证”CRF动物研究载体，同时可作为以“扶正祛邪”为治则的中药复方研究的动物模型，但因实验局限性，未能明确该模型具体的脏腑虚损和内邪种类，仍需进一步的研究与探索。