背俞指针疗法对GERD大鼠胃起搏区MLCK及PMLC20表达水平的影响❋

黄美祯， 谭金晶， 宋庆增， 刘礼剑， 韦金秀， 周晓玲， 黎丽群， 岑前丽， 李建锋， 谢 胜△

(1.广西中医药大学， 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院， 南宁 530023；3.柳州市中医院，广西 柳州 545001)

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是指胃或十二指肠内容物反流入食管，从而引起反酸、烧心等与反流相关症状或并发症的疾病[1]。GERD为多发性疾病，其全球总体发病率为13%并呈上升趋势[2]。研究发现，GERD具有病程长、复发率高等特点，可增加肺癌、食管癌、冠心病等多种疾病的发病风险，严重影响患者的身心健康和生活质量[3]。因此，积极防治GERD对公共卫生事业具有重大意义。本团队前期研究发现，背俞指针疗法治疗GERD疗效确切，可显著改善食管下括约肌压力及胃电节律，明显减少酸反流[4-6]。然而，该疗法治疗GERD作用的分子机制尚未完全明确。

食管、胃动力障碍是GERD的主要发病机制之一，而胃动力障碍与平滑肌结构、功能异常密切相关[7-9]。研究表明，胃平滑肌细胞内肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)通过使肌球蛋白调节性轻链(20kD Myosin light chain phosphorylation, MLC20)磷酸化，形成磷酸化肌球蛋白调节性轻链(phosphorylation 20kD Myosin light chain phosphorylation, PMLC20)，从而活化肌球蛋白ATP酶，引起平滑肌的收缩，故MLCK- PMLC20信号通路在调控平滑肌细胞运动功能中起重要作用[10，11]。因此，本研究以GERD大鼠为研究对象，探讨MLCK-PMLC20信号通路异常是否为GERD的发病机制，并观察背俞指针疗法对该信号通路的影响，明确该疗法治疗GERD的分子作用机制。本研究已通过广西中医药大学实验动物伦理委员会审查，伦理学批准号DW20180101-25。

1 材料与方法

1.1 动物

适龄清洁级SD大鼠124只，雌雄各半，体质量220～250 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK(湘)2016-0002。饲养于广西中医药大学第一附属医院动物实验中心动物房，温度20～25 ℃，相对湿度50%～65%。

1.2 主要试剂及仪器

荧光定量PCR试剂盒(货号RR047A、RR820A)TaKaRa公司；MLCK(货号bs-4705R)及PMLC2(货号bs-19149R)抗体，北京博奥森公司；IgG免疫组化试剂盒(货号SABC-POD)，武汉博士德公司。

展烤片机TY-7FB(天津爱华)；超速低温离心机1730R(美国 Sigma 公司)；光学显微镜Olympus-BH2(日本Olympus公司)；显微摄像仪 Olympus-C35AD-2(日本 Olympus 公司)；病理切片机 LEICA RM2135(德国RM公司)；分光光度计 722 型(四川仪表九厂)；7000型荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；紫外透射仪 ZF-90 (上海顾村电光仪器厂)；紫外分光光度计 752型(上海精密科学仪器有限公司)；图像分析系统Image-Pro Express(日本 Olympus 公司)。

1.3 造模及分组方法

将购回的124只SD大鼠进行标记，采用随机数字表法随机抽取30只作为空白组(开腹后不手术即缝合，无反流对照组)，其余94只SD大鼠建立GERD模型。大鼠购回后适应环境7 d，手术前禁食24 h。采用经食管支架植入术造模[12]：大鼠麻醉后备皮，碘伏消毒术区后开腹，将钢圈 (直径0.31 mm, 内径3.5 mm, 长5～6 mm) 套在鞘芯上, 从口腔经食管送于贲门处, 先退出鞘芯再退出鞘, 用鱼线 (0.4号, 0.10 mm)将钢圈固定于贲门处, 腹腔内注入青霉素后关腹。空白组进入腹腔前的操作同模型组，开腹后使用0.9% NaCl溶液灌洗腹腔，缝合线逐层关腹。所有大鼠术后禁食24 h不禁水，4周后随机抽取4只大鼠的食管标本进行病理检测，明确造模成功后根据随机数字表法随机分为模型组、指针组及西药组各30只。

1.4 干预方法

1.4.1 西药组 西药组参考《动物与人体的每公斤体质量剂量折算系数表》[13]计算出每只大鼠干预所需剂量。给予枸橼酸莫沙必利分散片(成都康弘药业集团股份有限公司，批号H20031110，1.56 mg/kg)每日均分灌胃3次，每次1 mL；兰索拉唑肠溶片(汕头经济特区鮀滨制药厂，批号H10980136，3.125 mg/kg)每日均分灌胃2次。空白组和模型组给予等量纯水灌胃，各组均干预14 d。

1.4.2 背俞指针组 参照文献选取大鼠双侧足太阳膀胱经肝俞、胆俞、脾俞、胃俞穴，于每天上午9～11点进行干预[14]。先将大鼠固定于俯卧位，左手罩住头部，右手轻抚背部4 min。指针操作如下：不同穴位从上到下、相同穴位由左至右，对每个穴位进行相应点压、按揉等手法操作，刺激量以大鼠无挣扎为度，频率为120～160次/min，时间为3 min/穴，每只大鼠每天手法操作24 min，疗程为2周。干预前对相关人员进行2周培训，在电子天平仪上练习，力求达到按揉质量200～250 g、点压质量300～350 g的标准。

1.5 标本采集

实验周期结束大鼠禁食不禁水12 h后，采用放血法将麻醉(25%乌拉坦6 mL/kg腹腔注射)后大鼠处死，随后进行食管组织及胃组织标本取材，于食道贲门上缘处取出食管组织约3 cm，于大鼠胃窦处(距幽门约0.5 cm)取10×10×5 mm3的平滑肌条，切取实验所需的胃起搏区组织-80 ℃保存。

1.6 检测指标

1.6.1 各组大鼠一般情况 观察各组大鼠的精神状态、反应、毛色、粪便、饮食、饮水量等，观察各组大鼠存活率和手术造模伤口愈合情况。

1.6.2 光镜下观察食管中下段组织病理变化 各组均随机抽取8只大鼠作为观察样本，将取出的食管组织经HE染色后在光镜下观察组织的鳞状上皮、上皮细胞层、黏膜固有层的病理变化，并进行对比分析。

1.6.3 荧光定量PCR法检测胃起搏区组织MLCK mRNA的表达情况 取出胃起搏区平滑肌组织，切取实验所需量(30～50 mg)，采用Trizol法提取总RNA，紫外-分光光度计测定所提取RNA浓度及含量，采用TaKaRa公司试剂盒行常规逆转录聚合酶链反应，逆转录所用的引物根据GenBank登录的MLCK核苷酸序列设计引物，委托宝生物工程(大连)技术服务有限公司进行合成，上游引物5’-GTGGTGGTAGCGGAGAGAAG-3’，下游引物5’-CCTTGTGGCCAGTTCATCCT-3’，引物长度为144bp。反应条件：预变性(94 ℃，5 min)；变性(95 ℃，30 s)；退火(60 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，30 s)，共进行40个循环的扩增，以上反应流程均参照TaKaRa公司试剂盒说明书进行。反应完成后采用SYBRGreenⅠ法进行扩增产物定量检测，扩增反应于ABI 7000荧光定量PCR仪上进行，并采用2-ΔΔCT法比较各组MLCK mRNA表达水平的差异。

1.6.4 免疫组化法观察胃起搏区组织MLCK及PMLC20的表达 切取大鼠胃起搏区(胃体中部距贲门1/3处)组织约1.0 cm3，石蜡切片4 μm，烤片后脱蜡至水，高压抗原修复，依次滴加3%过氧化物酶阻断液(室温10 min)、5% BSA封闭液(室温30 min)、一抗(1∶300,4 ℃过夜)，二抗(37 ℃孵育30 min)及SABC(37 ℃孵育30 min)，DAB显色，苏木素复染，脱水透明，中性树胶封片。用已知阳性切片作阳性MLCK及PMLC20对照，用PBS代替一抗作阴性对照。每张切片随机选取5个视野，采用image-Pro图像分析系统，测定并计算出平均光密度值(mean optical density, MOD)，用于各组MLCK及PMLC20表达水平的比较。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

空白组大鼠反应敏捷，毛色光泽，粪便正常；模型组大鼠反应较迟钝，毛色无光泽，粪质干硬，每日饮食、饮水量稍减少，可见少量反流物；指针组及西药组大鼠反应较模型组敏捷，毛色较光泽，指针组大便正常，西药组大便偏烂。各组大鼠均无死亡，造模组大鼠伤口愈合良好。

2.2 GERD大鼠干预后食管中下段组织病理变化

图1示，各组食管黏膜组织病理变化，空白组食管黏膜组织形态正常，未见黏膜糜烂及溃疡，黏膜上皮未见增生，固有层未见炎性细胞浸润；模型组食管鳞状上皮基底细胞中度增生，基底细胞层增厚，固有层乳头延长，固有层内炎性细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主，细胞间隙增宽；指针组食管黏膜结构基本恢复正常，鳞状上皮修复完整，基底细胞呈单层排列，黏膜固有层未见明显的乳头增生及炎性细胞浸润；西药组食管黏膜结构基本恢复正常，黏膜固有层未见明显的炎性细胞浸润。

图1 各组大鼠食管黏膜中下段组织鳞状上皮、黏膜固有层、上皮细胞层病理变化比较(HE×200)

2.3 GERD大鼠干预后胃起搏区组织MLCK及PMLC20表达结果

剔除异常数据后，空白组、模型组、西药组、模型组分别纳入11、12、11、14个样本分析MLCK mRNA表达水平。表1示，与空白组比较，模型组大鼠MLCK mRNA表达水平明显降低(P<0.05)；西药组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；指针组较模型组及西药组明显升高(P<0.05)。

图2、3示，MLCK及PMLC20阳性表达细胞分布于胃起搏区组织内环外纵肌层间，呈棕黄色染色。表1示，与空白组比较，模型组MLCK及PMLC20的表达水平有所下降(P<0.05)；与模型组比较，西药组及指针组MLCK及PMLC20的表达水平有显著上升(P<0.01)；与西药组比较，指针组的MLCK表达水平降低(P<0.05)，而西药组和指针组PMLC20表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 MLCK mRNA、MLCK阳性产物及PMLC20阳性产物表达比较

图2 各组大鼠胃起搏区组织肌球蛋白轻链激酶(Myosin Light Chain Kinase，MLCK)免疫组化阳性表达(200×)

图3 各组大鼠胃起搏区组织磷酸化肌球蛋白调节性轻链(Phosphorylation 20kD Myosin light chain phosphorylation，PMLC20)免疫组化阳性表达(200×)

3 讨论

目前国内大部分学者认为，GERD的基本病机为脾胃升降功能失常，胃气上逆[15]。本团队多年来致力于GERD的实践与研究，认识到“脾胃气机失衡是GERD发病的表象，而任督二脉经气升降交会失衡是脾胃升降失衡GERD的病机本质”[16，17]。督脉为阳脉之海，与膀胱经交会于大椎等穴位及巅顶部，故膀胱经之经气可通诸阳之会，调达一身之阳气。背俞穴是五脏六腑之精气输注于膀胱经上的穴位。本团队前期研究发现，在背俞穴处施予背俞指针疗法可调节任督二脉经气的交会，改善多个脏腑的功能，从而达到治疗GERD的目的[4-6]。基于此，笔者团队提出“以俞调枢”的观点，构建了“以俞调枢”理论体系[16，17]。同时前期临床研究表明，背俞指针疗法可以促进胃肠收缩及蠕动，降低食管括约肌压力和减少酸反流，治疗GERD效果确切[4-6]。本次研究的病理结果显示，与模型组比较，指针组食管黏膜结构基本恢复正常，食管组织炎症消失，提示背俞指针疗法可以改善GERD模型大鼠的食管黏膜病理改变，促进炎症消退。这可能与此疗法能调节任督二脉穴位的皮温，调节二脉经气的交会，进而改善脾胃之气机升降功能有关[18]。

MLCK是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶[19]。MLCK使肌球蛋白调节性轻链磷酸化并控制骨骼肌、平滑肌和心肌的收缩[20]。胃排空障碍与胃平滑肌收缩密切相关。在调节平滑肌收缩机制中, MLCK可使 MLC20磷酸化，磷酸化后的MLC20为PMLC20，可以使肌球蛋白ATP酶活化，触发肌动蛋白-肌球蛋白交叉桥接机制，引起平滑肌的收缩。在平滑肌的MLCK-PMLC20通路中，MLC20磷酸化水平在一定程度上决定着平滑肌收缩的功能。MLC20磷酸化的程度取决于MLCK活性，而MLCK mRNA是合成MLCK的模板[20]。本研究发现，模型组大鼠在胃起搏区的MLCK mRNA、MLCK及PMLC20蛋白表达水平均低于空白组大鼠，说明GERD大鼠胃动力障碍可能与MLCK及PMLC20表达量降低有关，且与其他胃动力障碍性疾病大鼠模型的胃平滑肌MLCK和PMLC20表达水平变化相一致[21-23]。

本次研究中，干预后指针组中MLCK mRNA水平较模型组升高，且MLCK及PMLC20阳性蛋白表达均高于模型组，说明背俞指针疗法能上调GERD大鼠胃起搏区MLCK mRNA、MLCK及PMLC20阳性蛋白表达，从而达到治疗GERD的目的。于上午脾经当令之巳时(9～11点)进行背俞指针疗法，可激发膀胱经经气, 从而使任督二脉经气升降交会，以恢复脾胃之气机升降，调畅五脏六腑脏腑枢机，恢复MLCK-PMLC20通路的“枢机”。结合病理结果说明，背俞指针疗法治疗GERD可能是通过上调胃起搏区MLCK mRNA、MLCK及PMLC20这一机制起作用。然而，西药组的MLCK mRNA表达与模型组比较差异无统计学意义，其蛋白表达水平却高于模型组，说明2组虽然以同等水平mRNA为模板合成的MLCK没有增加，但是用药后可能使合成MLCK的其他相关因子增加，或者使蛋白相较模型组分解减少，从而提高西药组MLCK的表达，具体机制尚未明确。西药组的MLCK蛋白表达水平高于指针组，但是最后2组间的PMLC20蛋白表达水平无明显差异，可能与指针组还能通过其他途径增加MLC20磷酸化有关，值得进一步探讨。

综上所述，GERD的发病可能与MLCK mRNA、MLCK、PMLC20蛋白表达水平下降有关。背俞指针疗法可明显改善GERD大鼠食管病理改变，其机制可能与上调MLCK mRNA、MLCK、PMLC20蛋白表达水平有关。然而目前尚有许多问题,如背俞指针疗法是如何上调MLCK mRNA及其蛋白表达,其是否会通过除MLCK的其他通路影响MLC20磷酸化，均有待今后进一步的研究。