肝癌微环境对髓源性抑制细胞的影响

李雪艳，王昌俊

1 南方医科大学 中医药学院，广州 510000； 2 广东省人民医院 中医科，广东省医学科学院，广东省老年医学研究所，广州 510000

肝细胞癌(HCC，简称肝癌)的发生率在所有癌症中居第六，致死率居第四，仅次于肺癌、大肠癌、胃癌。主要风险因素有HBV/HCV感染、酒精性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、黄曲霉素B1的摄入等[1]。癌症免疫疗法是近年新兴的治疗方法，可以在晚期癌症患者中诱导持久的抗肿瘤反应和长期缓解。但其在肝癌患者中的疗效有限，主要是因为肿瘤微环境内存在着大量免疫抑制细胞，如髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)。研究[2-4]发现，与健康受试者相比，肝癌患者的外周血、脾脏、肝脏中的MDSC均显著升高且MDSC的数量与肝癌患者的预后呈负相关。为了提高肝癌患者的治疗疗效，改善其预后及总体生存期，探讨MDSC在肝癌微环境中募集、分化的分子机制是必要的。

1 MDSC的定义、表型和分化

MDSC是起源于造血干细胞的异质细胞群，不成熟的表型和强效的免疫抑制能力是其显著的特征。在小鼠中，根据淋巴细胞抗原Ly-6C和Ly-6G的表达可将MDSC分为两种类型，一种表型为CD11b+Ly-6GlowLy-6Chi，与单核细胞的形态相似，称为单核MDSC(monocytic-MDSC，M-MDSC)；另一种表型为CD11b+Ly-6G+Ly-6Clow，与粒系细胞的形态相似，称为多形核MDSC(polymorphonuclear-MDSC, PMN-MDSC或granulocytic-MDSC，G-MDSC)[5]。人类中的MDSC与小鼠相似，也分为两类，M-MDSC的表型为CD11b+CD33+CD14+CD15-HLA-DR-/low，G-MDSC的表型为CD11b+CD33+CD14-CD15+HLA-DR-/lowCD66b+[6]。近期有研究[7]发现，凝集素型氧化LDL受体1(LOX-1)是人类PMN-MDSC的特异表面标记，在肝癌患者中可检测到LOX-1+CD15+PMN-MDSC水平升高。

在癌症中，髓样祖细胞的分化因微环境信号的改变而改变。巨噬细胞是起源于骨髓的单核细胞，在不同的环境信号刺激下可分化为不同的类型，在脂多糖和IFNγ刺激下可分化为经典活化的M1型，产生促炎因子，刺激T淋巴细胞增殖活化，抑制肿瘤生长；而在肿瘤微环境中的IL-4、IL-10刺激下可分化为M2型巨噬细胞，产生IL-10、TGFβ，促进肿瘤细胞生长。与肿瘤相关巨噬细胞相似，MDSC对不同的环境信号也具有极高的可塑性。研究[8]发现，在体外MDSC可分化为巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞(DC)。在肿瘤来源的信号因子和缺氧刺激下，MDSC可分化为免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞。

肝癌微环境主要由肿瘤细胞和肿瘤基质细胞构成，肿瘤基质细胞主要包括肝星状细胞(HSC)、肿瘤相关成纤维细胞、肿瘤血管内皮细胞(tumor endothelial cells，TEC)等，这些细胞均能诱导MDSC的募集、增殖，进而调控肝癌微环境中的免疫状态。此外，HCC是典型的炎症相关的癌症，慢性炎症促进肝癌的发生发展，在肝癌微环境中有大量异常的细胞因子分泌和免疫细胞、炎症细胞浸润，如Kupffer细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、DC、CD8+T淋巴细胞。MDSC与这些免疫细胞相互作用，通过不同的分子机制发挥免疫抑制作用。

2 肝癌细胞对MDSC的影响

2.1 肝癌细胞抑制MDSC的成熟 MDSC是机体在长期慢性炎症刺激下造血前体细胞病态激活的产物[9]。而肝癌主要在肝硬化的基础上发生，与长期慢性炎症高度相关[10]。在肝癌的微环境中存在着大量的细胞因子、趋化因子及各种炎症细胞的浸润，在这种炎症环境信号刺激下，造血前体细胞不能分化成有效杀伤肿瘤的免疫细胞，而是形成免疫抑制性细胞。研究[11]发现衰老的肝细胞能分泌趋化因子(CCL)2，募集趋化因子受体(CCR)2+髓样细胞并使其成熟以清除衰老肝细胞，防止肿瘤的发生，然而肝癌细胞能阻止募集的髓样细胞成熟，导致免疫抑制性的MDSC在肿瘤内积聚。

2.2 肝癌细胞诱导MDSC的募集 研究发现肝癌患者体内的一些酶类的表达水平与健康人有显著差异，如受体相互作用蛋白激酶(receptor-interacting protein kinase 3，RIP3)、胞嘧啶脱氨酶(apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide-like 3B，APOBEC3B 或A3B)、细胞周期相关激酶(cell cycle-related kinase，CCRK)。进一步的机制研究表明，这些酶类在肝癌细胞中的表达改变可激活其内的多条信号转导通路，产生细胞因子(IL-6)、趋化因子(CXCL1、CCL2)、生长因子(G-CSF)，诱导MDSC的募集和增殖，进而促进肝癌的发生、发展及转移。

RIP3能将TNF诱导的细胞死亡从凋亡转变为坏死，通过减少炎症因子释放保护肝脏免受炎症损伤，在炎症性肝癌的发生发展中有重要抑制作用。研究发现RIP3在肝癌患者中的表达减少且其表达水平与人肝癌内浸润的MDSC相关。在肝癌小鼠模型中敲低RIP3能磷酸化P65Ser536并促进磷酸化的P65Ser536核易位，增加HCC细胞中趋化因子(CXCL1)的表达，进而通过CXCL1- CXCR2轴诱导MDSC募集至肝癌内[12]。

APOBEC3B(A3B)是一种胞嘧啶脱氨酶，能催化胞嘧啶转变为尿嘧啶，导致DNA序列突变，此种突变模式在多种类型肿瘤中广泛存在。研究[13]发现肝癌患者中A3B表达上调，但是却未发现APOBEC突变模式，机制研究表明上调的A3B通过与多梳阻遏物复合物2相互作用抑制球形H3K27me3的富集，进而减少H3K27me3与CCL2启动子的结合，激活肝癌细胞内CCL2的转录，导致大量MDSC募集至肝癌微环境中，促进肝癌的发生发展。

CCRK也称为细胞周期蛋白依赖性激酶20，是细胞周期蛋白依赖性激酶家族的最新成员，主要参与细胞周期控制和转录调节，在肝炎病毒相关肝癌和代谢相关肝癌的发生发展中均有重要促进作用。近期有研究表明CCRK可通过募集MDSC促进肝癌免疫抑制性微环境的形成。Sun等研究发现肝癌细胞中过表达的CCRK可激活mTORC1信号转导通路和NF-κB信号转导通路，分别上调mTORC1依赖的G-CSF表达和IL-6表达，增强PMN-MDSC募集[14-15]。另外，在黑色素瘤和结直肠癌小鼠模型中，肝细胞内过表达的CCRK可通过激活NF-κB信号转导通路，增加CXCL1的表达，导致大量PMN-MDSC浸润至肝脏内，形成免疫抑制的转移前微环境，促进肿瘤的肝转移[16]。靶向这些细胞因子、趋化因子转录调控的的上游激酶，与单独使用趋化因子抑制剂相比可更有效地增强肝癌的抗肿瘤免疫治疗。

CCL15是单核细胞的强效趋化因子，特异性表达于肝脏和肠道组织中。研究[17]发现CCL15是人类肝癌组织中表达最多的趋化因子，肝癌细胞通过上调CCL15，募集大量具有免疫抑制作用的CCR1+CD14+单核细胞至肿瘤浸润边缘，并增强MDSC表达多种免疫抑制介质(如免疫检查点配体、吲哚胺酶、精氨酸酶及炎症因子和趋化因子)以及转移介质(如促血管生成因子、基质重塑蛋白酶)的能力，加速肿瘤的浸润和转移。除了以细胞自主的方式诱导MDSC募集增殖，肝癌细胞还可在炎症因子的作用下诱导MDSC募集。趋化素(Chemerin)是一种白细胞趋化因子，主要通过趋化素受体(ChemR23)趋化单核细胞、巨噬细胞、NK细胞和DC，在人类和小鼠肝脏中广泛存在，肝癌患者肿瘤组织和血液中趋化素水平显著降低，研究[18]发现，在趋化素缺陷的Rarres2-/-小鼠中，肝癌细胞通过NF-κB信号转导通路，增加GM-CSF的表达，进而募集MDSC。另外，肝癌细胞还能分泌M-CSF诱导外周血PDL1+MDSC扩增。

潜伏转化生长因子β结合蛋白4(latent transforming growth factor beta binding protein 4，LTBP4)属于LTBPS家族，是细胞外基质的重要组成成分。在细胞外基质中，LTBP与LAP(TGFβ1前体肽)、TGFβ1结合形成潜在复合物，使TGFβ1处于无活性状态。研究[19]发现LTBP4表达水平与晚期HCC患者的转移相关。敲除肝癌小鼠模型中LTBP4基因，可诱导HCC细胞分泌更多活性TGFβ1，进而募集MDSC，促进肝癌转移。肝癌细胞与MDSC之间通过复杂的细胞因子、趋化因子网相互促进，仅仅靶向抑制一种细胞因子治疗肝癌的疗效是有限的，通过联合使用多种靶向抑制细胞因子的药物或许可以提高肝癌患者免疫治疗的疗效。另外靶向肝癌细胞中的多种酶类可以改善肝癌内的免疫抑制微环境，提高抗肿瘤免疫，可作为肝癌免疫治疗的一种辅助疗法。

3 HSC对MDSC的影响

超过90%的肝癌病例发生在慢性炎症、纤维化、硬化的肝脏中，而HSC是参与肝纤维化和肝硬化的重要基质细胞。HSC位于肝细胞和窦状内皮细胞之间的Disse间隙中，是细胞外基质的主要来源，参与肝损伤后的再生修复。此外，HSC具有强大的免疫调控作用，通过诱导效应T淋巴细胞凋亡，调节性T淋巴细胞产生抑制自体T淋巴细胞免疫应答。近期研究发现HSC还能通过多种机制诱导MDSC产生以形成免疫抑制性的肿瘤微环境。

3.1 HSC诱导成熟单核细胞分化为M-MDSC 在肝癌患者肿瘤周围的纤维化肝脏中有大量M-MDSC富集，进一步的机制研究表明，活化的HSC能分泌细胞因子，激活成熟的外周血单核细胞内p38MAPK信号转导通路，诱导单核细胞分化为M-MDSC[20]。HSC还能够以细胞间直接接触的方式诱导MDSC的分化。研究[21]证实HSC能在体外通过CD44与外周血单核细胞相互作用，诱导其分化为CD14+HLA-DR-/lowMDSC，阻断CD44能逆转这一现象。另外，有研究者发现在器官移植中，与肝基质细胞、HSC共同移植，可实现胰岛同种异体移植的长期存活，其分子机制是HSC能分泌可溶性因子诱导骨髓细胞分化为MDSC，抑制免疫应答[22]。

3.2 HSC诱导MDSC募集 与肝癌细胞募集MDSC相似，活化的HSC也能分泌IL-6诱导MDSC产生，且HSC诱导的MDSC高表达诱导型一氧化氮合酶和精氨酸酶1，能强效抑制T淋巴细胞的抗肿瘤免疫应答。与单独HCC肝移植相比，在HCC和HSC共移植的小鼠肝肿瘤模型中观察到肿瘤大小显著增加并可检测到更多的MDSC[23]。HSC还可分泌基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor 1，SDF1)(也称为CXCL12)，通过SDF1/CXCR4轴促进骨髓和脾脏中的MDSC向肝内迁移[24]。活化的HSC也能分别通过COX-2/PGE2依赖的途径和补体C3途径诱导肿瘤组织中G-MDSC和M-MDSC的增殖[25-26]。HSC在肿瘤微环境中MDSC的蓄积发挥着重要作用，如果抑制HSC活化，MDSC的数量也会显著减少。研究[27]发现甘露聚糖结合凝集素能抑制HSC的活化，减少肿瘤浸润的MDSC。靶向HCC中的HSC可调节肿瘤微环境中的免疫应答，提高肝癌免疫疗法的疗效。

4 MDSC与肝癌微环境中其他细胞的相互影响

肿瘤相关的成纤维细胞在肝癌的发生、发展、转移和血管生成中均有重要的促进作用。此外，癌相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAF)也参与调控肝癌微环境中的免疫应答。先前有研究[28]表明CAF能通过SDF1a/CXCR4轴募集DC，并通过IL-6介导的STAT3激活诱导正常DC转变为免疫抑制性的DC。Deng等[29]发现CAF能通过相似的机制诱导MDSC的产生，即通过SDF1a/CXCR4途径吸引单核细胞，并通过IL-6介导的STAT3激活诱导其分化为MDSC。丰富的血管是肿瘤重要的生物学标志。TEC的表型和功能特征与正常的血管内皮细胞不同，其表面表达有更多的血管内皮生长因子受体、表皮生长因子受体和血小板源生长因子受体以满足其快速血管生成的需要[30]。除促进肿瘤血管生成外，TEC也能通过NF-κB信号转导通路分泌IL-6，募集MDSC以促进肿瘤细胞逃避免疫清除[18]。

抑制T淋巴细胞的功能和增殖是MDSC发挥免疫抑制的主要方式，除了抑制固有免疫系统外，MDSC也能抑制多种天然免疫细胞，通过固有免疫和天然免疫的双重抑制，使得MDSC在肝癌微环境中发挥强大的免疫抑制作用，促进肝癌的进展。MDSC可以诱导Kupffer细胞表面共刺激分子CD86和MHCⅡ表达减少，而共抑制性分子CD274增多，削弱Kupffer细胞的抗原递呈能力[31]。肝癌患者的MDSC能够抑制自体NK细胞的细胞毒性及IFNγ的释放，这种抑制是以一种细胞间直接接触的方式，主要通过NK细胞表面的NKP30受体[32]。在肝癌小鼠模型中MDSC通过产生IL-10抑制DC产生IL-12并抑制DC对T淋巴细胞的刺激活性[33]。

5 缺氧与MDSC

缺氧是肿瘤微环境的一个显著特征，MDSC倾向于浸润至肝癌组织的缺氧区域。处于缺氧环境中的肝癌细胞通过缺氧诱导因子1上调胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶2的表达，胞外核苷三磷酸二磷酸水解酶2将细胞外ATP水解为5′-AMP，导致细胞外5′-AMP水平升高，进而阻止MDSC的分化，促进MDSC的蓄积[34]。缺氧诱导因子也能激活肝癌细胞内CCL26的转录，进而募集表达CX3CR1的MDSC至肿瘤内[35]。

6 展望

鉴于MDSC在肝癌微环境免疫抑制状态形成中的重要作用，靶向MDSC可作为肝癌免疫治疗的一个潜在靶标。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)是细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞、NKT淋巴细胞组成的免疫细胞混合物。将CIK过继转移至荷瘤小鼠中可诱导肿瘤微环境中炎症介质(CX3CL1、IL-13)的产生，增加肿瘤内浸润的MDSC，减弱抗肿瘤免疫应答。用5型磷酸二酯酶抑制剂逆转MDSC的抑制功能可增强CIK的抗肿瘤疗效[36]。提示靶向MDSC可作为辅助治疗增强肝癌免疫疗法的疗效。Wu等[37]发现在巨大肝肿瘤和结直肠癌多发性肝转移的小鼠模型中，姑息性射频消融能通过增加肿瘤内浸润的MDSC，减弱T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫应答，加速残余肿瘤的进展。表明射频消融结合靶向MDSC治疗或许可延迟肿瘤复发，改善患者预后。总之，靶向MDSC可作为一种抑制HCC进展的辅助疗法，成为今后研究肝癌治疗方法的重点。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：李雪艳负责论文构思和撰写；李雪艳、王昌俊参与论文修改；李雪艳拟定写作思路，撰写文章并最后定稿。