成纤维细胞生长因子21在非酒精性脂肪性肝病中的应用现状与展望

金雷钢，耿磊落，徐爱民

香港大学 a.生物医药技术国家重点实验室，b.内科系，c.药理与药剂系，香港特别行政区 999077

1 FGF21的生物学功能

人成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)是一类由22个成员组成，具有调节细胞分化、增殖和代谢等一系列生理功能的细胞因子家族。FGF21是FGF家族成员之一，与FGF19、23同属于内分泌型FGF亚组[1]。2000年，Nishimura等[2]率先克隆出FGF21基因，但直到2005年，FGF21作为一个新的代谢调节因子的生物活性才被首次报道：Kharitonenkov等[3]发现FGF21可通过刺激葡萄糖转运体1(glucose transporter 1, GLUT1)的表达，促进小鼠3T3-L1脂肪细胞和人原代脂肪细胞的葡萄糖摄取。后续实验进一步证实，FGF21这种主要由肝细胞表达的蛋白可明显提高机体胰岛素敏感性，并维持能量代谢平衡。在自发性2型糖尿病db/db小鼠或高脂饮食诱导的肥胖小鼠中，FGF21同样具有良好的降血糖和胰岛素增敏功效[4]。在2型糖尿病非人灵长类动物模型实验[5]中，重组FGF21蛋白能够显著降低体质量、持续降低血糖和甘油三酯至正常水平，改善胰岛素抵抗，并能减轻脂肪肝病变。在生理状况下，FGF21能够感受机体的营养状况，并调控全身代谢平衡。饥饿或者长时间的禁食可以通过激活核受体过氧化物酶体增殖激活物受体α(PPARα)信号通路，诱导小鼠肝FGF21的表达，上调血液中FGF21的水平，进而依次促进脂肪组织的脂解以及脂肪酸的释放，肝脏继而吸收脂肪酸并将其转化为酮体，从而调控机体能量平衡。此外，FGF21也能够进入大脑，激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，促进皮质酮的释放及肝糖异生，维持机体的糖代谢平衡[6-7]。最近研究[5,8-10]表明，FGF21还能显著改善脂质代谢紊乱，包括降低低密度脂蛋白胆固醇、增高高密度脂蛋白胆固醇，在治疗肥胖、动脉粥样硬化以及脂肪肝等疾病过程中有着广泛的潜力。

传统的FGF家族通过结合细胞膜具酪氨酸蛋白激酶活性的FGF受体(FGFR)而发挥作用，但FGF21缺少肝素结合位点，因而能够从表达器官分泌至血液，作为一个内分泌因子发挥其生物功效。同时，FGF21本身必须与相关的辅助受体相结合才能通过FGFR来共同行使其生物学功能，FGF21的C-末端与一种叫β-klotho的跨膜蛋白相结合后，其N-端再与FGFR相结合，形成稳定FGF21/β-klotho/FGFR复合体后，激活下游相关的分子信号，从而发挥其生物效应[11]。FGFR1c为FGF21的优先受体，在各个组织中广泛表达；而其辅助受体β-klotho只在肝脏、脂肪、胰腺和中枢神经等几种代谢活跃的组织中有较高表达[12]。脂肪组织是FGF21作用的重要靶器官。最近研究[13]表明，FGF21调控机体血糖平衡、胰岛素敏感性和脂质代谢与脂肪细胞产生的脂联素(adiponectin)存在密切的关系。FGF21可以通过激活PPARγ信号通路上调脂肪细胞中脂联素的表达和分泌。动物实验[8,13]进一步证实，脂联素是FGF21发挥其维持机体血糖稳定，增加胰岛素敏感性以及降低肝脏、肌肉中脂肪堆积，抑制肝脏胆固醇合成等相关生物效应的重要下游功能介导因子。

2 FGF21对肝代谢调控和肝损伤的保护作用

肝组织作为FGF21最主要的内分泌器官，同时也是FGF21作用的重要靶器官。早期研究[4,14]发现，与野生型小鼠相比，FGF21基因缺失能显著增加小鼠生酮饮食后的体质量，并明显加剧肝脂肪变性，损害酮体合成功能。近期研究[15]表明，给予小鼠重组FGF21蛋白能够抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1的活性，增加肝胰岛素敏感性。FGF21也可以通过诱导过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的表达，促进肝脂肪酸氧化[16]；通过抑制固醇调节元件结合蛋白-1c水平，减少肝脂肪生成[17]；此外，外源性FGF21能够有效抑制衣霉素(tunicamycin)引发的肝脏内质网应激[18]；也可以通过抑制核因子-κB，改善二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化[19]。另有动物实验[20]表明，对乙酰氨基酚过量引起的肝损伤和病死率在FGF21基因敲除小鼠中明显加重，重组FGF21通过诱导肝脏中过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的表达，上调抗氧化应激转录因子核因子E2相关因子2及其他抗氧化基因的水平，从而改善肝氧化应激和损伤。

尽管FGF21的辅助受体β-klotho在肝组织中大量表达，但由于介导FGF21作用的优先受体FGFR1在正常肝细胞中表达很低，肝细胞是否是FGF21直接的作用生理靶点依然存在争议[12,21]。Gong等[15]研究发现，敲低肝内β-klotho的水平将加重肝胰岛素抵抗，且FGF21介导的胰岛素增敏作用和降血糖效应消失。小鼠给予外源性FGF21后能够激活肝细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)的磷酸化，调控FGF21下游基因在肝脏中的表达[22]。但另有细胞实验[16]显示，当对离体的小鼠肝脏或大鼠原代肝细胞直接给予FGF21刺激后却没有任何生物学效应。另外，对肝特异性β-klotho基因敲除小鼠和野生型小鼠给予FGF21处理后，2种小鼠均显示出了同等程度的血糖和体质量降低、肝脂质堆积改善、胰岛素敏感性上调等效应[23]。这些结果提示了FGF21对肝代谢等功能的调控可能是由机体其他组织间接介导的(图1)。在高脂饮食诱导的脂联素缺失肥胖小鼠中，FGF21对肝胰岛素增敏、改善肝脂肪变性及保护肝功能的作用均明显减弱，表明FGF21-脂联素信号轴在调控肝代谢上发挥着重要功效[13]。此外，FGF21可以通过血脑屏障进入大脑，激活下丘脑-垂体-肾上腺轴发挥其调控肝糖异生的作用[7]。尽管上述研究阐述了FGF21对肝脏的调节与保护作用，但对于其调控肝代谢、减轻肝损伤的具体分子机制仍有待进一步探索。

3 FGF21作为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)及肝损伤的生物标志物

尽管FGF21具有多重代谢保护作用，前期研究[24-25]发现FGF21循环水平在NAFLD 患者及肥胖诱导的脂肪肝小鼠模型中却明显升高。Fisher等[25]研究发现，高脂饮食诱导的NAFLD小鼠肝脏中FGF21 mRNA水平显著增高。针对欧美人群的横断面研究[24,26]显示，血液FGF21水平在NAFLD和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中明显高于正常对照组。上海交通大学贾伟平教授团队[27]发现，相比于正常人群，血液及肝脏中FGF21的水平在NAFLD患者中显著上调，且血液中FGF21水平与甘油三酯呈正相关，而与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关。血液及肝脏中FGF21水平随着肝脂肪变性程度的增加而逐步升高，提示FGF21水平的改变与肝糖脂代谢紊乱及胰岛素抵抗密切相关，并可能参与了肝脂肪性病变的发生发展[27]。该团队随后对808例上海社区人群进行了3年随访的前瞻性研究[28]，结果显示FGF21基线水平高者，发生NAFLD的风险明显增加，且血液FGF21水平随着NAFLD病情的发展而逐步增高。由于NAFLD也是一种慢性的炎症疾病，肝脏炎症水平增加是脂肪肝进展的主要标志，最新研究[29]证实，FGF21与NAFLD患者血清中IL-6呈相关性，提示FGF21可能反映疾病的严重程度和病理进程。在另一项针对179例NAFLD患者和91例健康正常人群的临床研究[30]显示，循环水平的FGF21与NAFLD的进程呈线性相关，且FGF21水平在NASH患者达到最高值。此外，在NASH患者中，血液FGF21的水平也与肝脏坏死性炎症、纤维化及细胞角蛋白18水平呈正相关[31]。上述研究成果也提示,FGF21可作为一个敏感的预测NAFLD病情进展的生物学标志物。

在针对其他肝损伤的临床研究中，急性病毒性肝炎患者血液中FGF21水平显著升高，且与ALT和AST水平呈正相关[32]。此外，Ye等[33]通过检测肝移植缺血/再灌注患者血液中FGF21水平及其他肝功能指标后发现，相比于正常对照组，血液中的FGF21在缺血/再灌注发生后的2 h即显著升高，而ALT、AST的活性在24 h后才明显上调。相较于转氨酶的滞后反应，FGF21的高灵敏度也为肝移植缺血/再灌注患者的早期诊断和病程干预提供了可能性，具有潜在的临床应用价值。

4 FGF21用于治疗NAFLD的临床试验现状

FGF21是FGF家族中目前发现的唯一没有促有丝分裂功能的家庭成员，这种独特的生物学特性也大大降低了其在临床用药上的诱癌风险。然而，由于天然的人FGF21生物学特性有诸多不足，难以发展其成为临床药物。这些缺陷包括: 首先，FGF21药代动力学性能较差，生物半衰期一般只有0.5～1 h[5]；其次，FGF21蛋白保存在溶液中很容易被降解、在体外易聚集，构象上的非常不稳定使其在大规模表达和纯化的过程中也会存在困难[34]。基于上述原因，研究人员运用生物工程技术开发了许多长效的FGF21类似物和针对FGF21受体复合物(FGFR1/β-klotho)的激动剂。尽管发展这些FGF21类似物及受体激动剂的主要初始目的是用于治疗肥胖或糖尿病，但近期数项临床试验却意外发现其对NAFLD的良好疗效。

4.1 PEG化人FGF21类似物： Pegbelfermin(BMS-986036)

Pegbelfermin (BMS-986036)是百时美施贵宝公司研发的一种聚乙二醇化的人FGF21类似物。此前一项Ⅱa期临床研究(NCT02097277)[35]显示，2型糖尿病伴NAFLD患者在给予pegbelfermin后，血糖控制指标——糖化血红蛋白并未明显改善，但血液中肝纤维化的生物标志物——Ⅲ型胶原N-末端前肽(PRO-C3)却显著下降。因而，最近的一项Ⅱa期临床研究(NCT02413372)[10]进一步评估了pegbelfermin在NASH患者中的安全性和有效性，结果表明pegbelfermin可有效改善NASH患者(F1～3期，肝脂肪含量≥10%)的肝纤维化程度及其他相关代谢指标。在这项多中心、随机、双盲Ⅱa期研究中，纳入的75例NASH患者随机接受每日1次皮下注射pegbelfermin (10 mg)或每周1次pegbelfermin (20 mg)或安慰剂，共16周。与安慰剂组相比，接受pegbelfermin治疗的患者症状在8周即出现改善；16周后实验组患者血清中的PRO-C3、ALT、AST 水平显著降低，脂联素水平明显升高，肝脂肪绝对含量明显下降。接受10、20 mg pegbelfermin组的患者肝脂肪绝对分数分别减少6.8%和5.2%，而安慰剂组仅为1.3%。目前正在进行的另2项平行的Ⅱb期临床研究(NCT0348689，NCT03486912)预计于2021年底完成，用以评估pegbelfermin在更多NASH和肝硬化患者中的有效性和安全性。

4.2 Fc与FGF21的融合蛋白： Fc-FGF21 (AKR-001或efruxifermin) 研究人员将人FGF21与人IgG1的Fc片段融合，得到Fc-FGF21蛋白，与野生型FGF21相比，融合蛋白可有效延长FGF21的循环半衰期，提高生物利用度，同时能抵抗蛋白酶水解，增加稳定性[36]。前期动物实验[36]表明，Fc-FGF21能够显著降低肥胖猕猴血清中的血糖及甘油三酯水平，改善胰岛素抵抗。最近，Akero Therapeutics公司于2020年美国肝病学会年会上汇报了FGF21-Fc融合蛋白efruxifermin(EFX, 旧称AKR-001)在Ⅱa期临床研究[37-38](NCT03976401)中的数据，证实了EFX具有治疗NASH的潜力。80例符合要求的NASH患者随机接受每周1次皮下注射EFX(28、50、70 mg)或安慰剂16周。结果显示在接受EFX治疗12周后，50例患者肝脂肪含量减少30%；治疗16周后，与安慰剂组相比，注射28、50和70 mg EFX的剂量组均达到主要终点(由MRI质子密度脂肪分数评估的肝脂肪相对于基线的绝对变化)，其肝脂肪相对减少分别为63%、71%和72%。同时，肝脂肪的绝对减少率分别为12%、13%和14%，安慰剂仅为0.3%。研究者随后对40例肝脂肪相对减少≥30%的受试者进行进一步的肝活检发现，8%和28%的治疗响应者分别实现了1个级别及2个级别的肝纤维化改善；48%的响应者实现了NASH消退，并且未发生纤维化的恶化。此外，在所有剂量组中也观察到胰岛素敏感性的上升，脂蛋白谱的改善以及体质量减轻。EFX改善NASH的亮眼表现使其在在研药物中展现出了极强的竞争力。目前，一项关于EFX的Ⅱb期临床研究(NCT04767529)也已启动，用以进一步观察其在NASH患者中的临床效果。

4.3 FGF21受体激动剂： BFKB8488A和NGM313(MK-3655) 除上述的FGF21蛋白类似物外，研究人员也发现几种FGF21受体激动剂在治疗NASH过程中展现出了相当的潜力，并已进入临床试验阶段。其中比较有代表性的是基因泰克公司研发的单抗激动剂BFKB8488A和默沙东公司研发的NGM313 (现称MK-3655)。最近的一项Ⅰb期临床研究(NCT03060538)[39]显示，肥胖伴随NAFLD的患者在注射BFKB8488A后体质量明显降低，血液脂联素水平增加，心血管代谢指标得到改善。同时，注射BFKB8488A使患者ALT水平下降10%～30%，PRO-C3水平降低约37%±17%，肝脂肪含量降低约38%±5%[40]。目前正在进行另一项Ⅱ期临床研究(NCT04171765)用以进一步评估其安全性和有效性。NGM313也是最近研发出的一种人源化FGF21受体单克隆抗体激动剂，可以与β-klotho的特定表位结合，并能够选择性地激活FGFR1c受体介导的信号通路。近期公布的Ⅰb期临床研究(NCT03298464)[41]结果表明，单次注射NGM313可以显著降低肥胖且伴有胰岛素抵抗的NAFLD患者肝脂肪含量，改善多项代谢指标。目前，NGM313的研究已经推进到Ⅱb期临床试验(NCT04583423)，其便利的给药方式(每月单次)有可能成为其超越其他同类药物的突破点。

综上所述，多种FGF21类似物和FGF21受体激动剂的安全性、耐受性、药效以及药代动力学已经在临床上得到初步验证，然而在临床试验中，这些蛋白的不良反应报道也不容忽视。在针对几种FGF21蛋白变构体的临床研究中，给予Pegbelfermin和LY2405319 (礼来公司研发的长效FGF21突变体)后，50%以上的患者体内检测到抗FGF21的抗体[35,42]。此外，值得注意的是，上述药物的临床试验都停留在短短几周或数月的观察时间，考虑到NAFLD、2型糖尿病等代谢性疾病都属于慢性病，患者需要长期或者终身给药治疗，长期给药的安全性及风险依然有待于进一步的临床研究。

5 总结与展望

FGF21作为一种主要由肝细胞分泌的蛋白，对维持机体内的糖脂代谢平衡具有至关重要的作用。大量的临床试验也证实FGF21治疗代谢性肝病具有很大的潜力。然而，其在临床的开发及应用上依然面临不少的挑战。前期的细胞及动物实验表明FGF21能够有效促进葡萄糖吸收，在啮齿类和非人灵长类动物中也具有良好的降血糖效应，而在后续的临床试验中，其调节机体血糖的功效却令人失望，FGF21相关药物治疗糖尿病的临床实验研究也基本上均止步于一期。在另一方面，前瞻性研究中观察到血液 FGF21 水平是NAFLD的可靠生物标志物。最近的动物和临床研究[43]也证实FGF21能够有效调节肝脂质代谢、改善肝脂肪含量和纤维化，其良好的药效使得FGF21成为治疗NAFLD和NASH等慢性肝脏疾病的新型候选药物。

通过对FGF21蛋白进行重组改造与修饰，以及对其受体复合物激动剂的研发，工程化的FGF21类似物克服了野生型蛋白半衰期短、药代动力学性能较差的缺陷，在临床试验中取得了令人鼓舞的结果。然而，FGF21类似物在NAFLD和NASH患者中发挥治疗功效的同时，也伴随着一些问题和不良反应的出现。首先，Ⅰ/Ⅱ期临床试验的患者在给予不同种类的FGF21类似物或受体激动剂治疗后，其机体代谢指标的变化不尽相同；其次，接受FGF21给药后，患者往往会出现骨骼生长受抑制、骨密度降低、产生抗FGF21抗体等副作用[44]。尽管经历多年的研究，但对于FGF21的生理功能和药理机制仍未完全阐明，依然有大量问题有待解决：(1)为何FGF21在生理状态和药理作用下会出现明显不同的效应？(2)为何在动物实验中FGF21类似物良好的抗肥胖抗糖尿病功效却在人体试验中疗效甚微，FGF21在不同物种之间作用差异的原因是什么？(3)FGF21改善NAFLD的功效是直接作用于肝细胞，还是通过促进脂肪细胞分泌脂联素或者大脑-肝脏之间的调节而发挥间接效应，其具体的分子机制有哪些？(4)机体在肥胖状态下，全身或者靶器官是否存在与胰岛素抵抗相类似的“FGF21抵抗”效应，“FGF21抵抗”是否会促进肥胖相关的代谢性疾病的发生与发展？(5)FGF21类似物在Ⅰ/Ⅱ期临床试验的人数较少，观察时间较短，其长期疗效、最佳治疗窗口和副作用等方面的证据相对有限。因此，需要在不同种族人群中针对更大样本量的NAFLD患者进行更长时间的临床试验，以进一步验证FGF21类似物及其受体激动剂在治疗该病的临床效果及评估长期用药后的安全性。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：金雷钢负责收集分析资料，撰写论文；耿磊落负责论文修改；徐爱民拟定写作思路，指导文章撰写并最后定稿。