饲料中添加沸石对慢性肾衰犬结肠尿素转运蛋白B及氨转运体蛋白Rh表达的影响

朱道仙，刘 莉*,陆 江，梅素红,袁华根，赵学刚

(1.江苏农牧科技职业学院 动物医学院，江苏 泰州 225300；2.江苏农牧科技职业学院 宠物科技学院，江苏 泰州 225300)

在慢性肾衰(CRF)时，尿素经肾排泄障碍，血液中大部分尿素可通过自由扩散或经尿素转运蛋白B(UT-B)转运弥散入肠道，肠道排泄成为尿素清除的重要途径[1-2]。但大量尿素进入肠道也为结肠菌群提供了丰富的氮源，会被含脲酶的细菌分解产生大量的氨[3]，在氨转运体蛋白Rh的作用下这些氨可快速进入门静脉，随后在肝中重新合成尿素，再次释放入血，形成了尿素的肝肠循环，从而减少了尿素经肠排泄，使氮质血症不能及时改善，甚至可导致高血氨症，严重危害动物的生命安全。前期研究发现用益生菌抑制CRF犬肠道含脲酶菌群后，可改善氮质血症，也证实了尿素的肝肠循环会影响尿素的经肠排泄。

沸石是一种含水的铝硅酸盐矿物，特殊的结构使其拥有良好的吸附、离子交换、分子筛等作用[4]。大量研究表明，沸石具有维持肠黏膜屏障功能，提高消化酶的活性，提高营养物质利用率，抗氧化作用和提高机体免疫力等多种功能，已被广泛应用于饲料工业[5-9]。但关于沸石对尿素肝肠循环的调节作用研究甚少。为此，本研究在CRF犬饲料中添加沸石，评价其对CRF患犬结肠尿素转运蛋白B及氨转运体蛋白Rh表达的影响，探讨其对尿素经肠排泄的调节机制，为沸石在CRF犬饮食疗法中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料饲料级沸石粉，购于河南信阳万山矿物制品厂。

1.2 实验动物及分组20条2岁左右的中华田园犬，体质量为(6±1) kg，由江苏农牧科技职业学院宠物科技学院试验犬房提供。参照王宁等[10]的方法，将15只犬采取肾动脉结扎法制作慢性肾衰模型，第4周末每组随机抽取3只犬，检测血清肌酐、尿素水平均升高，提示造模成功。然后按随机数字表随机分为模型组(MD)、低剂量沸石组(LCD)和高剂量沸石组(HCD)，每组5只。另5只犬只做腹壁切开，作为假手术对照组(SOG)。MD组和SOG组饲喂基础饲料，LCD组为1%沸石饲料，HCD为5%沸石饲料，试验连续 4 周，整个试验过程所有犬进水及饮食均不受限制。基础饲料参考《犬营养标准》(NRC-2016)配制，其组成及营养水平见表1，沸石饲料组成见表2。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) %

表2 不同沸石含量饲料的配制 %

1.3 尿素氮检测试验结束后，将试验犬放在代谢笼中24 h，收集尿液用尿素检测试剂盒(购于武汉艾美捷科技有限公司)进行尿尿素(uUrea)的测量。然后，经头静脉采集各组试验犬的血液并制备血清，用M149928-全自动干式生化分析仪测定血清尿素氮(BUN)。同时，收集新鲜粪便，测质量后按1∶9比例用7%三氯乙酸溶液稀释搅匀，经5 000 r/min离心10 min后取上清液检测粪便尿素氮(FUN)，方法同上。

1.4 门静脉中氨的检测试验结束后，各组犬取门静脉抗凝血5 mL，3 000 r/min离心5 min，制备血浆，然后用谷氨酸脱氢酶法测定氨(NH3)的含量，检测试剂盒购于长春汇力生物技术有限公司。

1.5 结肠黏膜中相关基因mRNA表达丰度测定试验犬麻醉致死后打开结肠，清除结肠内容物，在结肠表面用刀片轻轻刮取，收集黏膜层，一部分置于RNA保存液中，于-80℃保存，用于结肠黏膜中UT-B、氨转运体蛋白Rhb(Rhbg)及氨转运体蛋白Rhc(Rhcg)基因mRNA表达的qRT-PCR检测。具体步骤：Trizol法提取结肠组织中总RNA,使用TaKaRa反转录试剂盒将其反转录为cDNA,扩增采用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行,每管总反应体积25 μL,温度循环设计为95℃ 2 min；95℃ 5 s；60℃ 10 s，共40个循环，引物设计由上海生工合成(表3)。以β-actin为内参，基因表达量用2-ΔΔCt法计算。

表3 相关基因mRNA表达的引物设计

1.6 结肠黏膜中UT-B、Rhbg及Rhcg蛋白表达测定称取约40 mg结肠组织,加入1 mL裂解液,采用超声波震碎法置于冰上操作进行匀浆,4℃、10 000 r/min 离心10 min,吸取上清移入干净EP管内,运用BCA法测定蛋白浓度。根据SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围，选择12%分离胶及5%浓缩胶进行凝胶电泳、转膜、封闭、洗膜、杂交、发光反应。以GAPDH为内参照,利用Image J软件对各组蛋白条带进行灰度值分析。

2 结果

2.1 沸石对慢性肾衰犬尿素氮的影响从表4可以看出，MD组的BUN、FUN均显著高于SOG组，而尿Urea显著降低(P<0.01)。与MD组比较，HCD组BUN、FUN降低，有显著性差异(P<0.05)，而LCD组无显著性差异(P>0.05)。LCD组、HCD组尿Urea与MD组无显著性差异(P>0.05)。

表4 沸石对慢性肾衰犬尿素氮的影响

2.2 沸石对慢性肾衰犬门静脉血氨的影响由表5可知，MD组门静脉中氨的水平显著高于SOG组(P<0.05)，HCD组门静脉中氨的水平显著低于MD组(P<0.05)，LCD组与MD组门静脉中氨的水平无显著差异(P>0.05)。

表5 沸石对慢性肾衰犬门静脉血氨的影响 μmol/L

2.3 沸石对慢性肾衰犬结肠黏膜中相关基因mRNA表达的影响由图1可知，与MD组比较，HCD组Rhbg、Rhcg基因和LCD组Rhcg基因的mRNA表达水平均显著下调(P<0.05)。与SOD组比较，MD组Rhbg、Rhcg基因的mRNA表达均显著上调(P<0.05)。UT-B基因的mRNA表达水平在各组间均无显著性差异(P>0.05)。

注：不同小写字母上标表示2组间相互比较，P<0.05。下同图1 沸石对慢性肾衰犬结肠黏膜中Rhcg、Rhbg及UT-B基因 mRNA表达的影响

2.4 沸石对慢性肾衰犬结肠黏膜中UT-B、Rhbg及Rhcg蛋白表达的影响如图2A所示，UT-B、Rhbg及Rhcg在各组结肠中均有不同程度表达。UT-B在各组间表相对达量无显著变化(图2B)。HCD组的Rhbg、Rhcg相对表达量和LCD组的Rhcg相对表达量均低于MD组，差异显著(P<0.05)；与SOG组比较，MD组的Rhbg、Rhcg相对表达量均显著升高(P<0.05)(图2C，D)。

A.3种蛋白在各组中的表达；B.UT-B；C.Rhbg;D.Rhcg图2 沸石对慢性肾衰犬结肠黏膜中UT-B、Rhbg及Rhcg蛋白表达的影响

2.5 慢性肾衰犬BUN水平与UT-B、Rhbg及Rhcg相对表达量的相关性分析对慢性肾衰犬BUN与Western blot 检测的UT-B、Rhbg及Rhcg相对表达量进行了Pearson相关性分析,可以看出，BUN与UT-B的相关系数较低，且没有显著性差异(图3A)，与Rhbg的相关系数约为0.75，P<0.05(图3B)，与Rhcg的相关系数最高，P<0.05(图3C)。说明慢性肾衰犬BUN水平与Rhcg呈强的正相关，与Rhbg呈中等正相关，与UT-B无相关关系。

图3 BUN水平与UT-B、Rhbg及Rhcg相对表达量的相关性

3 讨论

在CRF状态下，尿素不能充分经肾排泄而蓄积于体内，大量尿素通过丰富的肠壁毛细血管进入肠腔，一部分重吸收入血,另一部分在结肠中的细菌作用下生成氨,重新吸收入血又为尿素的合成提供了原料，剩余部分随粪便排出体外。有研究表明，尿毒症患者平均每天经肠道可清除70 g尿素，远远高于健康者。研究已经证实，蒙脱石、沸石、药用炭等可以吸收消化道中尿素[11-13]，但具体的分子作用机制尚不清楚。而本研究发现，CRF犬的BUN、FUN均高于SOG组，但给与沸石后显著降低，而尿中Urea排泄量变化不大，说明CRF时机体可经肠排泄尿素，沸石可促进这一路径，与上述观点一致。

尿素可通过简单扩散由血液穿过肠黏膜上皮细胞进入肠腔，但由于尿素是极性分子，不易通过细胞膜的脂质双分子层，可能会影响CRF时尿素由血入肠的数量与速率。研究表明，尿素通道蛋白家族(UT)是一类特异通透尿素的跨膜蛋白，介导尿素在浓度差驱动下快速穿过细胞膜，其通透速度远超过简单扩散[14]。而UT-B是UT家族中一员，在结肠黏膜上皮细胞顶膜有大量分布[15]，当给予小鼠低蛋白饮食时，肠道上皮细胞UT-B的表达量会降低，减少氮经肠排泄，维持正氮平衡，证实了UT-B对尿素从血液向肠腔转移有调控作用。研究显示，UT-B介导的细胞膜尿素通透性是脂质双层膜尿素通透性的50倍[16]。然而本研究发现，给予CRF犬高剂量沸石后对UT-B的mRNA和蛋白表达均无显著性影响，而且CRF犬的BUN与UT-B表达量之间无相关关系，提示UT-B不是沸石调节BUN经肠排泄的作用靶点。但最近在小鼠和人类结肠中又发现了一种肠道UT-A转运体[17]，这表明可能不止一种尿素转运体参与了尿素在肠黏膜上皮细胞上的运动，沸石是否可能通过其他UT促进BUN经肠排泄还有待于进一步研究。

Rhbg、Rhcg是最近研究发现的可介导氨转运的氨转运蛋白家族的新成员，广泛分布于消化道、肾脏、大脑等组织，参与顶端膜和基底膜的氨转运[18-20]。本研究发现，CRF时结肠黏膜Rhbg、Rhcg表达水平和门静脉血氨均高于SOG组，相关性分析也发现，CRF犬的BUN与Rhbg、Rhcg蛋白表达量呈正相关。这可能由于CRF时大量尿素进入肠道，大部分被结肠细菌分解利用产生了过多的氨，刺激Rhbg、Rhcg表达上调，加速这些氨进入门静脉，然后可在肝脏中重新合成尿素后再次释放到血中，增加了BUN水平，降低了BUN的经肠清除作用，仅有少部分尿素或氨随粪便排出体外。给予沸石后，可显著降低CRF犬结肠黏膜Rhbg、Rhcg表达和门静脉血氨，减少了尿素的肝肠循环，说明沸石对CRF犬BUN经肠排泄的通路具有促进作用，可能与下调结肠黏膜Rhbg和Rhcg表达有关。

综上所述，CRF时可增强犬的尿素肝肠循环，减少BUN经肠排泄。给予沸石后，可减轻尿素肝肠循环，降低BUN、FUN和门静脉血氨，缓解高氮血症，其机制可能与下调结肠黏膜Rhbg和Rhcg表达有关，以饲料中添加5%沸石剂量最佳。