检测猪圆环病毒4型实时荧光PCR方法的建立及应用

张 倩，王金凤，刘立兵，付 琦，袁万哲，赵 款，马宏伟，马增军，王建昌*，韩庆安*

(1.河北省动物疫病预防控制中心，河北 石家庄 050035；2.河北科技师范学院 动物科技学院，河北 秦皇岛 066004；3.石家庄海关技术中心，河北 石家庄 050051；4.河北农业大学 动物医学学院，河北 保定 071001)

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)为无囊膜单股负链环状 DNA 病毒，属于圆环病毒科(circoviridae)、圆环病毒属(circovirus)，是目前发现最小的在哺乳动物体内复制的DNA病毒之一[1-2]。目前已报道的猪圆环病毒有4种：猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1，PCV1)于1974年被首次发现并被证实对猪无致病性[3-4]；猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)于1998年首次报道，目前已成为与多种猪临床疫病综合征相关的最重要病原之一[5-6]；猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3，PCV3)是2016年从美国患病猪中首次鉴定出的一种新型猪圆环病毒[7-8]，目前已通过细胞培养成功分离[9]，但致病性还有待进一步研究[10-11]；猪圆环病毒4型(porcine circovirus 4，PCV4)是2019年在我国湖南省患有严重临床疾病(包括呼吸道疾病、腹泻和猪皮炎与肾病综合征)的猪群中首次发现的一种新型PCV，与PCV1～3型具有显著的遗传差异[12]。猪圆环病毒4型(PCV4)的基因组大小约为 1 770 nt，包含12个开放阅读框(open reading frame，ORF)，其中ORF1和ORF2是两个主要的开放阅读框。ORF1大小为 891 nt，编码296个氨基酸的复制酶蛋白(replicase protein，Rep)；ORF2大小为687 nt，编码228个氨基酸的衣壳蛋白(capsid protein，Cap)[12]。

目前研究表明，PCV4在我国湖南、河南、山西、江苏和广西等地猪场中均存在不同程度的流行[12-16]。周继勇等[12]对湖南省187份样品的检测结果显示，PCV4阳性率高达12.8%，且在鼻拭子和血清样品中阳性率最高。TIAN等[13]对河南省和山西省63份样品的PCV4检测阳性率为25.40%，在淋巴结、肺脏和肾脏中阳性检出率较高，依次为66.67%,17.14%,15.38%。田润博等[14]后续对河南省137份样品的检测结果表明，PCV4阳性率为13.87%； 在肺和脾脏中的检出率最高，分别为21.43%和14.29%。陈南华等[15]对2016-2020年江苏省的120份样品进行了检测，PCV4阳性率为3.33%。黄小武等[16]对广西56份临床样品的PCV4检测阳性率为 3.57%。但是在意大利和西班牙的300份猪样品中未检测到PCV4，目前在其他国家也未见PCV4感染的报道[17]。

目前对PCV4的检测主要通过PCR或荧光PCR方法进行。本研究拟基于PCV4的ORF2基因，设计特异性引物和TaqMan探针，建立一种有效检测猪临床样品中PCV4的实时荧光PCR方法，并对不同时期采集的868份河北省猪临床样品进行检测，以期为PCV4相关疫病的早期诊断和分子流行病学调查提供技术支持，了解河北省猪群中PCV4的流行情况。

1 材料与方法

1.1 病毒、细菌和临床样品含有PCV4基因组全长序列的质粒(pUC57-PCV4质量浓度为25 mg/L)，根据GenBank中收录的PCV4参考株序列(MK986820.1)由上海生工合成；PCV1、PCV2、PCV3、伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的基因组DNA和cDNA，大肠杆菌(E.coli)和沙门菌(Salmonella)基因组DNA，均由本实验室于-80℃保存。

868份猪临床样品(扁桃体、淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏)收集自2013—2020年间河北省10个不同地区的养殖场和屠宰场。

1.2 主要试剂与仪器病毒DNA(RNA)提取试剂盒，购自西安天隆科技有限公司；2×GoTaq®Probe qPCR Master Mix、2×GoTaq®Green Master Mix，购自Promoga公司；T-Vector pMD-19(Simple)，购自宝生物工程(大连)有限公司；Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell，购自北京全式金生物技术有限公司。

高通量组织研磨仪(MM400)，德国RETSCH公司；NP968核酸自动提取仪，西安天隆科技有限公司；核酸蛋白测定仪(Nanodrop ND-2000)，美国Thermo公司；实时荧光PCR仪(StepOne Plus)，美国Thermo公司。

1.3 引物和探针的设计与合成根据GenBank已收录的PCV4基因序列(登录号：MK986820.1、MT015686.1、MT311854.1和MT769268.1)，经比对确定ORF2基因保守区域，利用Express3.0软件设计1对特异性引物和1条TaqMan探针，预期扩增产物的大小分别为69 bp；利用Primer 5.0软件设计1对能够扩增包含ORF2基因全长的特异性引物，预期扩增产物的大小为708 bp。所有引物探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物和探针序列

1.4 核酸提取取50～100 mg组织病料，加入约1 000 mL PBS进行匀浆。充分匀浆后，12 000 r/min离心5 min，取上清，并按照病毒核酸提取试剂盒说明书，使用天隆全自动核酸提取仪进行自动提取。所提取病毒核酸于-20℃保存备用。

1.5 实时荧光PCR体系的优化以pUC57-PCV4为模板，采用矩阵法优化反应体系中引物和探针的浓度。反应体系为25 mL，其中2×Taq Probe qPCR Master Mix为12.5 mL，上下游引物(10 mmol/L)终浓度分别为0.2,0.4,0.6和0.8 mmol/L，探针(5 mmol/L)终浓度分别为0.1，0.2，0.3和0.4 mmol/L，模板2 mL，ddH2O补足至25 mL。反应条件为95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 35 s，40个循环，在60℃时收集荧光。

1.6 特异性试验以PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、PRRSV、PRV、PEDV、PPV、CSFV、E.coli和Salmonella基因组DNA或cDNA为模板，以ddH2O为空白对照，通过建立的实时荧光PCR方法进行检测，以分析其特异性。

1.7 敏感性试验按照公式：拷贝数(拷贝/mL)=6.02×1023×[质粒浓度(mg/L)×10-9/(质粒碱基数×660)]，计算pUC57-PCV4拷贝数为4.59×109拷贝/mL。将pUC57-PCV4作3倍稀释后，进行10倍倍比稀释，使之浓度范围在1.53×100～1.53×107拷贝/mL之间。分别取1 mL 10倍系列倍比稀释的pUC57-PCV4作为模板，以ddH2O作为空白对照，通过建立的实时荧光PCR方法进行检测，以分析其敏感性。

1.8 实时荧光PCR方法标准曲线的建立取1 mL 10倍倍比稀释的pUC57-PCV4(1.53×103～1.53×107拷贝/mL)作为模板，每个浓度设3个平行，通过所建立的实时荧光PCR方法进行检测，利用荧光PCR仪所带随机软件进行分析，绘制标准曲线。

1.9 重复性试验选择3个不同浓度(1.53×102,1.53×104,1.53×106拷贝/mL)的pUC57-PCV4为模板，进行实时荧光PCR扩增，分别进行3次组内和组间的重复性试验。根据Ct值，通过统计学方法计算组内和组间变异系数(CV值)，以评估其重复性。

1.10 临床样品的检测利用本研究建立的实时荧光PCR方法对实验室保存的868份猪临床样品进行PCV4检测，并选择部分PCV4阳性样品进行ORF2基因的扩增和分析。

1.11 ORF2基因全长扩增及测序选择Ct值较小的3份PCV4阳性样品，进行PCV4 ORF2全长扩增。PCR反应体系为25 mL：2×Taq PCR Master mix 12.5 mL，DNA模板5 mL，上、下游引物(25 mmol/L)各0.5 mL，dd H2O补足至25 mL；PCR反应条件：94℃ 5 min；95℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 1 min，34个循环；72℃ 6 min，1个循环。对PCR产物纯化回收后，连接pMD19-T载体，并将其转化入E.coli感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取单个菌落进行摇菌，PCR鉴定为阳性的菌液由北京中科希林生物科技有限责任公司测序。将测序结果与国内已发表的PCV4 ORF2基因序列进行同源性分析。

2 结果

2.1 实时荧光PCR反应体系的优化经过对反应体系的优化，确定实时荧光PCR的最佳反应体系为：2×Taq Probe qPCR Master Mix 为12.5 mL，上下游引物(10 mmol/L)各1.5 mL，探针(5 mmol/L)为2 mL，模板1 mL，ddH2O补足至25 mL。

2.2 特异性试验结果通过所建立的实时荧光PCR方法对PCV1、PCV2、PCV3、PCV4、PRRSV、PRV、PEDV、PPV、CSFV、E.coli和Salmonella进行检测，结果表明，仅PCV4出现特异性扩增，其他猪常见病原和空白对照均未出现明显的荧光曲线，表明所建立方法有良好的特异性(图1)。

1.PCV4;2.PCV1;3.PCV2;4.PCV3;5.PRV；6.PPV;7.PRRSV;8.CSFV;9.PEDV;10.E.coli;11.Salmonella;12.ddH2O图1 PCV4实时荧光PCR方法的特异性试验结果

2.3 敏感性试验结果取1 mL 10倍系列稀释的pUC57-PCV4作为模板，通过实时荧光PCR进行检测。结果显示，当质粒浓度为1.53×101拷贝/mL时，能够出现特异性扩增曲线；当质粒浓度小于1.53×101拷贝/mL，没有出现特异性扩增曲线(图2)。因此确定该方法的最低检出限为1.53×101拷贝/mL反应。

2.4 标准曲线的建立以系列稀释的质粒作为模板，利用所建立的实时荧光PCR进行检测，得到扩增标准曲线(图3)。结果表明，模板浓度在1.53×107～1.53×103拷贝/L内与Ct值呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=-3.27x+39.927，其相关系数(R2)为0.999，扩增效率为102%，说明标准曲线的线性度好，可信度高。

图3 PCV4实时荧光PCR方法标准曲线

2.5 重复性试验结果以3个不同浓度的质粒作为模板，每个浓度设3个平行，进行实时荧光PCR检测。结果表明，组内变异系数在0.31%～0.90%之间，组间变异系数在0.63%～1.05%之间，变异系数小于2%，表明所建立的荧光定量PCR方法的重复性好，稳定性高(表2)。

1.1.53×107 拷贝/L；2.1.53×106 拷贝/L；3.1.53×105 拷贝/L；4.1.53×104 拷贝/L；5.1.53×103 拷贝/L；6.1.53×102 拷贝/L；7.1.53×101 拷贝/L；8.1.53×100 拷贝/L；9.ddH2O图2 PCV4实时荧光PCR方法的灵敏性试验结果

表2 实时荧光PCR方法组内和组间重复性试验结果

2.6 临床样品检测结果通过所建立的实时荧光PCR方法对2013—2020年收集的868份临床组织样品进行PCV4检测。结果显示，11份样品PCV4核酸阳性，阳性率为1.27%(11/868)。进一步分析表明，11份阳性样品中8份为淋巴结，并且均收集自2019年(表3)。

表3 2013—2020年临床样品PCV4检测结果 份

2.7 ORF2基因测序结果选取3份PCV4阳性样品(Ct值分别为26.31，17.54，30.24)，进行病毒ORF2基因扩增及测序，获得3条ORF2基因序列，分别命名为Hebei-AP15-2019、Hebei-AP67-2019和Hebei-LS1-2019，并上传至GenBank(登录号分别为MW439193、MT995847、MW439192)。

进一步运用DNAStar软件中的MegAlign功能进行分析，结果表明Hebei-AP15-2019、Hebei-AP67-2019之间的核苷酸同源性为100%，同Hebei-LS1-2019之间的核苷酸同源性为99.1%。河北分离株同其他省份分离株ORF2基因同源性在98.4%～99.6%之间(图4)。Hebei-AP15-2019、Hebei-AP67-2019同广西分离株(PCV4/GX2020/NN88)、江苏分离株(JSYZ1901-2)和安徽分离株(AHbz/2018)同源性最高，为99.6%；同湖南分离株(HNU-AHG1-2019、HNU-AHZ-2019)同源性最低，为98.7%。Hebei-LS1-2019同广西分离株(PCV4/GX2020/NN88)、江苏分离株(JSYZ1901-2)同源性最高，为99.6%；同湖南分离株(HNU-AHG1-2019、HNU-AHZ-2019)、河南分离株(Henan-LY1-2019)同源性最低，为98.4%。

图4 PCV4河北分离株与国内分离株 ORF2序列的同源性比对

3 讨论

自2019年PCV4在猪群中被首次发现以来，引起了世界范围内的广泛关注。快速有效的检测方法对于了解PCV4在猪群中的流行情况，指导开展后续预防工作具有重要意义。目前已经建立了基于ORF1、ORF1-ORF2基因的PCV4实时荧光PCR方法[12-13,15-16]；基于ORF2基因的普通PCR方法[14]，并在不同地区猪群PCV4监测中发挥了重要作用。普通PCR方法需要琼脂糖凝胶电泳，无法实现快速检测。目前尚未见特异性检测PCV4 ORF2基因保守序列的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的报道。

Cap蛋白为PCV4的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，由ORF2基因编码。通过对目前GenBank中收录的PCV4序列进行比对，结果表明ORF2基因在PCV4中高度保守。本研究基于PCV4 ORF2基因保守序列，设计特异性引物和TaqMan探针，建立了特异性强、灵敏性高、重复性好的实时荧光PCR方法。本研究使用含有PCV4基因组全长序列的人工合成质粒作为模板，所建立方法在1.53×103～1.53×107拷贝/L的质粒浓度范围内呈良好的线性关系，R2值达到0.999，仅对PCV4呈现特异性扩增；组内、组间变异系数均小于2%。本研究建立的PCV4实时荧光PCR检测方法的最低检出限为1.53×101拷贝/L反应，同陈南华等[15]建立的四重实时荧光PCR方法中对PCV4的检测限(2.8×101拷贝/L)相近，明显低于黄小武等[16]针对PCV4 Rep基因建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法的检测下限(5.64×102拷贝/L)。相较于田润博等[14]建立的PCV4普通 PCR方法，本研究检测方法的灵敏性较其更高，且无需进行PCR产物的后续凝胶电泳，耗时更短，有效避免了“假阳性”结果的出现。

本研究涉及样品数量多，共计868份；样品来源广，来自河北省10个不同地市；时间跨度大，涵盖了2013—2020年样品。检测结果表明，近年来河北省猪群中存在PCV4的感染，但是感染率较低并局限于2019年样品。河北省PCV4的阳性检出率为1.27%(11/868)，与江苏省和广西省的PCV4检出率较为接近(3.33%，3.57%)[15-16]，明显低于湖南省和河南省的PCV4检出率(12.8%，13.87%)[12，14]。进一步分析表明，本研究中猪淋巴结样品的PCV4检出率最高(8/11)，与TIAN等[13]对我国河南省和山西省63份临床样品的检测的结果较为一致。进一步对3株河北分离株的ORF2基因测序分析表明，河北省不同猪群内PCV4之间存在一定的核苷酸差异，但是所有分离株均同广西、江苏分离株同源性最高(99.6%)，同湖南分离株同源性最低(98.4%，98.7%)。

目前在我国湖南、河南、江苏、山西、河北等省份猪群中均有不同程度的PCV4检出，但在国外未见相关报道[17]，表明PCV4可能在我国猪群中存在不同水平的流行和传播。本研究建立的PCV4 实时荧光PCR检测方法，为PCV4的快速检测及流行病学调查提供了技术支持，对于了解PCV4在我国猪群中的流行情况，从而进一步了解PCV4对猪的致病作用具有重要意义。