精子DNA碎片指数对体外受精胚胎及囊胚发育的影响

曲仕浩，罗英，周益平，郑煜丽，徐楗荧*

(珠海市妇幼保健院 1.男性生殖健康科；2.生殖医学中心，珠海 519000)

精子DNA碎片指数(DFI)是发生精子核DNA链断裂的精子占全部精子的百分比。精子核DNA携带男方遗传物质，其完整性对于遗传信息的准确传递至关重要，它具有高度紧凑和复杂的结构，并且能够消除精子的密集性，这是精子被认为具有繁殖能力所必须具备的特征。国内外多项研究已证实，任何形式的精子染色质异常或DNA损伤都可能导致男性不育，是评估男性不育的一个可靠指标[1-5]。Evenson等[6]首次将精子染色质结构分析系统参数用于男性生育力的评估，研究证实DFI≥15%时男性生育潜力明显下降，≥30%为低度生育力，≥80%为无生育能力。精子DFI与卵裂期胚胎及囊胚发育之间的关系，目前仍没有一致的结果。本研究对常规体外受精(IVF)患者的精液标本进行DFI检测，探讨其对IVF胚胎及囊胚发育的影响。

一、对象与方法

1.研究对象：选择2017年1月至2020年12月在珠海市妇幼保健院生殖医学中心接受常规体外受精(IVF)助孕的1 411个周期。纳入标准：女方年龄22～38岁；月经周期规律，血清FSH<10 U/ml；获卵数≥5 枚；男女双方染色体检查正常；临床资料齐全。排除标准：合并内、外科手术及IVF禁忌症者；子宫内膜异位症、排卵障碍；黄体期促排卵；移植失败周期>2次；因各种原因未完成控制性促排卵(COS)者。依据DFI分为A组(DFI<15%)、B组(15%≤DFI<30%)、C组(DFI≥30%)。

2.实验方法：应用精子染色质扩散法(SCD)检测精子核DNA的完整性，试剂盒购自深圳华康生物医学工程有限公司，具体操作参照说明书。

3.DFI结果判定标准：根据晕环与精子头部直径比例，分为大晕环、中晕环、小晕环、无晕环以及退化精子。计算公式[7]：DFI=(小晕环+无晕环+退化)精子/计数精子总数×100%。

4.IVF助孕：应用本中心常规的超排卵方案，给予基因重组FSH(rFSH，默克雪兰诺，德国)和/或尿源性FSH(uFSH，珠海丽珠)进行控制性促排卵，定期行B超监测卵泡发育。当至少有1个主导卵泡直径≥18 mm或至少2个主导卵泡直径≥17 mm时，注射重组人绒促性腺素(艾泽，默克雪兰诺，德国)250 μg，36～38 h后行阴道超声引导下取卵术。将卵母细胞置于培养箱(37℃、6% CO2)中培养3～6 h后行IVF，定期观察受精卵原核、胚胎或囊胚形成情况。

5.数据统计定义[8]：卵裂胚胎率=D3卵裂胚胎数/2PN数；优质胚胎率=优质胚胎数/卵裂胚胎数×100%；囊胚形成率=囊胚数/卵裂胚胎数×100%。

二、结果

1.各组患者一般情况比较：各组女方平均年龄、体质量指数(BMI)、不孕年限、获卵数及男方平均年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；随着DFI升高，精子浓度、前向运动精子率(PR)和正常形态精子率均呈显著下降趋势(P均<0.01)(表1)。

表1 一般情况比较

2.各组患者胚胎及囊胚发育情况比较：随着DFI升高，各组的受精率、2PN受精率、卵裂胚胎率及囊胚形成率均呈下降趋势。B组和C组的受精率、卵裂胚胎率均显著低于A组(P均<0.01)；C组的2PN受精率显著低于A组和B组(P<0.01)；B组和C组囊胚形成率显著低于A组(P<0.05)。各组的卵裂率及优质胚胎率相比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)(表2)。

表2 三组胚胎及囊胚发育情况比较(%)

三、讨论

一直以来，男性生育力的评估主要依赖于精子浓度、活力及正常形态等传统指标。近年来随着生命科学领域的进展和自动化仪器的普及，男科学也从简单和主观的计数及形态学观察，逐步进入到更为客观的生化分析阶段。精子DFI检测逐步在男科临床检验领域得到发展，在一定程度上从分子水平反映了男性生殖能力遗传结构基础和功能完整性[9]。

环状结构、螺线管结构和核基质结合域是人精子染色质的3个主要结构，这些结构与功能密切相关。精子DFI指数升高的发生机制主要有以下几个方面[10-12]：(1)控制凋亡的基因Fas、Bcl-x及p53等基因异常表达，细胞凋亡发生异常，从而不能及时去除DNA受损的精子，增高DNA碎片化导致精子DFI指数升高；(2)鱼精蛋白在维持精子正常形态DNA和完整性有着至关重要的作用，其自身缺陷或功能异常时精子染色质浓缩过程异常，导致精子DFI指数升高；(3)当 ROS过多和抗氧化酶的平衡失调时，精子DNA单链和双链的断裂导致精子DNA受损，受损伤的精子更容易受到ROS的攻击，形成恶性循环，从而加重了精子DNA 损伤程度。有研究显示，精子DFI指数与精子活力、前向运动率呈负相关，DNA损伤严重的精子引起其线粒体呼吸代谢功能明显降低，精子DNA损伤可能是导致弱精子症的重要原因之一[13-15]。本研究显示，随着DFI升高，精子浓度、前向运动精子率和正常形态精子率均呈下降趋势。

关于精子DNA损伤是否影响胚胎的质量目前尚存在争议，而且精子DNA损伤影响胚胎质量的机制仍不清楚。有观点认为，精子染色质的异常导致胚胎质量下降，精子DNA损伤会降低精子受精能力和胚胎发育潜能，精子DNA损伤与受孕率和胚胎质量呈负相关关系，从而降低妊娠率，并且肯定了精子DFI对男性不育结局的预测价值[16-18]；但也有研究显示，DFI与卵胞浆内单精子注射(ICSI)受精率、卵裂率、优胚率均无相关性[19]。本研究显示，胚胎、囊胚发育情况比较，受精率、2PN受精率、卵裂胚胎率及囊胚形成率随着DFI升高均呈下降趋势(P<0.05或P<0.01)；但随着DFI升高，各组的卵裂率及优质胚胎率的差异均无统计学意义(P>0.05)。精子DNA损伤能够广泛地影响胚胎受精、细胞分裂及发育等多个过程，胚胎自身有一定的自我修复能力，当DFI高的精子与卵母细胞受精后，卵母细胞将启动DNA修复程序，但严重的DNA损伤卵母细胞无法修复，通过激活凋亡通路诱导胚胎凋亡，从而影响胚胎的发育[20]。

因此，本研究探讨了精子DFI对IVF胚胎及囊胚发育的影响，精子DFI升高对男性精子产生负面影响，导致IVF受精率、卵裂胚胎率及囊胚形成率均下降，提示在常规IVF周期前检查精子DNA碎片率具有临床应用价值。