慢性乙型肝炎抗病毒新药的临床研究

张 洪，朱晓雪，买佳佳，陈 红，周 景，胡 月，徐 佳，丁艳华

吉林大学第一医院 Ⅰ期临床试验病房，长春 130021

HBV感染为世界性的流行，不同地区感染的流行率呈现不同程度的差异。据WHO报道，全球约有2.57亿慢性乙型肝炎(CHB)患者，占全部人口的3.5%，其中西太平洋地区和非洲的HBV感染率分别高达6.2%和6.1%，而欧美的流行率相对较低[1]。治疗目标为长期最大限度地抑制HBV复制，减轻肝脏炎症、肝纤维组织增生，延缓和减少肝衰竭、肝硬化失代偿等的发生，改善CHB患者生命质量，延长CHB患者生存时间。

在临床上，CHB的治愈分为两个层面，(1)临床治愈：停止治疗后仍保持HBsAg阴性(伴或不伴抗-HBs出现)、HBV DNA检测不到、肝生化学指标正常、肝组织病变改善。(2)完全治愈：指的是完全根除HBV，包括肝内cccDNA和整合的HBV DNA。目前乙型肝炎的治疗药物仅局限于核苷(酸)类似物(NAs)和干扰素两大类。NAs需要长期规范治疗，存在耐药问题，HBsAg的清除率一般也小于5%，且无法根除cccDNA。干扰素常规48周治疗可以抑制HBV DNA的复制，抑制cccDNA的形成，但HBsAg的阴转率仍很低，且存在较多的不良反应[2]。因此急需开发针对HBV不同靶点的治疗新药(图1)。研发过程中的临床研究显得尤为关键，因此本文对抗HBV临床研究关键点和代表性靶点的临床研究进行综述。

1 抗HBV新药临床研究关注点

1.1 受试人群 Ⅰa期临床研究对象为健康受试者，主要探索新药的耐受性和药物代谢动力学(PK)特点。Ⅰb及Ⅱ～Ⅲ期临床研究需要纳入CHB患者。慢性HBV感染的自然史可划分为：免疫耐受期、免疫清除期、免疫控制期和再活动期[3]。早期临床研究应集中于无肝硬化的成年患者，例如在初治活动性疾病患者，或者NAs、干扰素停药0.5～1年，且伴随疾病活动的患者，或是接受NAs治疗后，达到病毒学抑制的患者。重要基线特征包括HBV DNA、HBsAg、ALT水平、HBeAg阴/阳性和曾经抗病毒治疗时间等。Ⅱ～Ⅲ期临床研究人群应与药物的作用机制匹配。例如HBsAg抑制剂可集中在NAs治疗后获得病毒抑制的患者，重点关注对抗原的抑制作用。联合治疗是HBV获得功能性治愈的未来治疗趋势，需要分析不同靶点之间的相加或协同作用。选择合适的人群进行治疗也至关重要。建议根据受试者的基线资料进行分层，例如性别、病毒基因型和HBV传播方式等，但需要确保每一亚组患者的数量足够。甚至考虑肝硬化、失代偿人群的治疗效果和安全性[4]。

1.2 临床试验设计 Ⅰ期临床试验需要在健康受试者和HBV感染者中进行。观察药物的PK、耐受性、初步药效；试验包括单次给药和多次给药研究。试验最好采用随机、双盲、安慰剂对照设计以提高结果的准确性，排除受试者和研究者主观性的干扰。由于HBV需要长期治疗，在耐受性试验中给药的时间需要足够长，并达到稳态血药浓度(通常连续给药7天，除非受药物的毒性所禁忌)。由于CHB自然病程为多阶段性，Ⅱ～Ⅲ期临床研究建议用随机、双盲、对照的临床试验来分析疗效和安全性。例如，慢性抑制性治疗方案和有限疗程的治疗方案。慢性抑制性治疗方案在HBeAg阳性和阴性患者中，开展随机、对照试验，使用上市的药物作为对照，以治疗48周后 HBV DNA阴转率为疗效指标。有限疗程的治疗方案选择HBV已被NAs抑制的人群 (NAs治疗达到病毒学抑制的人群)。如果以停药后HBV DNA保持持续抑制，且同时HBsAg转阴作为主要疗效指标，可以考虑用NAs作为背景治疗，并与安慰剂比较，观察新增的研究药物是否提高药效。或者分析停药后HBV DNA是否持续抑制，以及HBsAg的下降水平。

1.3 安全、耐受性 一般而言，用于治疗CHB药物的上市申请的临床研究应包含1000～1500例患者。根据药物安全性和研究期间中发现的问题，可能需要更多患者和更长时间治疗结果的支持。临床研究需要制订肝炎发作或HBV再激活的具体分析、处理标准。研究方案包括出现重大不良事件时的处理措施，确保数据合理性。在临床研究期间，应对所有严重不良事件进行系统评估，鼓励独立评价委员会对安全耐受性进行评估。当药物适应证人群计划扩大到肝硬化人群时，需要考虑研究药物的安全性和失代偿肝硬化人群的总体获益风险[5]。抗HBV药物主要安全性问题是ALT水平反复升高，包括3种类型：第1种是由宿主免疫应答引起，伴HBV DNA、血清学标志物(例如抗原)水平的下降；第2种是由病毒活性增强所致，可能与病毒耐药有关；第3种是由药物的不良反应等引起，如药物性肝损伤，可以伴有胆红素升高，甚至凝血功能异常。为了区分不同类型的ALT升高，需要考虑治疗时间、HBV DNA水平、碱性磷酸酶和胆红素水平的变化，甚至进行肝组织学检查。

抗HBV相关的基因编辑技术目前发展非常迅速，但是随之而来的药物脱靶风险也可能发生。同时药物的载体也是潜在的风险，其分为病毒类和非病毒载体。目前多数采用的是非病毒载体，例如N-乙酰半乳糖胺作为靶向肝细胞的载体。临床方案设计时需要制订相应的脱靶风险控制计划。

1.4 药物代谢动力学(PK) 早期临床研究中，在健康志愿者和CHB患者中进行新药的PK研究，充分说明其PK特性及活性代谢物特征，例如性别和年龄、代谢酶、转运体、饮食、合并用药(药物相互作用)、肝肾损伤等对PK影响。如果计划用于肝病失代偿人群，还应在该部分人群进行相关的PK研究。PK参数包括峰浓度、达峰时间、半衰期、从给药开始外推到至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC)、稳态特点、药物经过尿粪排泄率、清除、蓄积等参数。在药物的早期临床开发阶段，可以探索性分析暴露/效应作用特点，为后续临床试验和临床应用提供指导。Ⅱb～Ⅲ期大样本量的临床研究中，通过稀疏采样的PK研究，同时纳入药效终点(PD)指标进行群体PK研究。尤其是为特殊人群制订相应的给药方案。例如估算肾小球滤过率(eGFR)≥15 ml/min且不合并HIV感染的CHB患者中，富马酸丙酚替诺福韦无需调整剂量，而其他NAs确需在eGFR<50 ml/min时调整用药剂量。

1.5 药效终点(PD) HBV功能性治愈的替代终点包括生化学、病毒学和组织学指标，其中HBsAg阴转伴或不伴血清学转换较难达到且对治疗结局影响重大，因此HBsAg阴转通常被当做替代终点。

在药物的临床研发初期，通常用HBV DNA水平的变化当做药效指标，免疫相关的抗病毒治疗可以纳入免疫应答相关的指标，进行短疗程、小规模的探索，并进行PK/PD分析，为后续研究提供指导。Ⅱ期临床试验通常为收集短期抗HBV药效和初步安全性观察，为Ⅲ期临床研究的设计提供依据，例如给药方案、试验对象。可以选择HBV DNA的动态变化或病毒学应答作为主要终点，评价时间通常为3～6个月。甚至采用HBsAg水平作为终点进行分析，评价时间通常为6个月。对于免疫相关的抗病毒治疗，需要注意免疫风暴的监测和处理[6-7]。

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Ⅲ期临床试验中，主要终点的设定取决于新药的治疗目标。目前已经有大量的临床研究数据支持HBV DNA定量与肝组织学改善的关系，即研究药物抑制HBV DNA定量后，就可以改善肝组织学。因此，在Ⅲ期临床确证性临床试验中，可以选择病毒学应答作为主要终点，疗程为48周或者以上，并开展持续病毒应答的观察。HBsAg阴转对于临床治疗是一个非常重要的目标，可以作为研究的主要终点，但需结合持续HBV DNA抑制(HBV DNA低于定量下限)考虑。同时建议进行次要终点的观察，例如组织学、血清学指标等。分析各指标的应答率和经时变化，例如病毒反弹包括耐药、病毒应答与治疗时间的关系。

早期临床研究中可以评估探索性终点，促进后期临床研究中合适终点的选择。例如：HBV RNA、HBV核心相关抗原(HBcrAg)、HBsAg/抗-HBs免疫复合物和cccDNA定量等水平的变化。这些指标取决于药物的作用机制。肝活组织检查可用于某些概念验证研究，作为确认新机制或已有的抗病毒药物研究的替代标志物。

HBV的变异在临床研究期间需要关注，其可能降低抗病毒药物药效[8]。临床研究期间制订HBV耐药变异分析计划，获得病毒变异特点，例如HBV DNA较最低值升高2 log IU/ml时，排除依从性问题后，需及时采取措施，并进行耐药分析。

1.6 基于定量药理学的临床研究 临床研究设计、运行和结束时，引入定量药理学研究方法，分析药物暴露量浓度-时间AUC与不良反应及药效学指标的关系，为后期临床研究打下基础。具体包括：(1)建立研究药物的PK模型、生理药代模型表征该化合物在健康受试者或CHB患者体内药物代谢情况。(2)采用上述模型制订早期患者疗效试验的给药方式和剂量，确保暴露量能覆盖体外抗HBV的EC50或者EC90值的数倍，或者覆盖动物药效学模型中暴露量的数倍，同时考虑血浆蛋白结合校正效应。(3)在临床试验前、方案设计时、运行期间和结束时分析药物PK/PD及不良反应的关系，为后期研究打下基础。分析体内药物AUC与动物无明显损害作用剂量和最大耐受剂量的药物在动物体内AUC的关系；分析AUC与不良反应时，应考虑研究药物作用机制相关的中靶和脱靶作用，以及发生率较高的不良反应。

1.7 药物-药物相互作用 CHB未来抗病毒治疗将是不同HBV靶点新药的联合治疗，以达到功能性治愈，因此还应尽早开展药物相互作用研究。早期临床试验阶段应针对药物吸收、分布、代谢环节，如代谢酶或转运体等，开展药物-药物相互作用研究，通常在健康受试者中进行。后期临床研究也可以开展群体药代动力学研究，有助于描述药物-药物相互作用，得到不同靶点抗HBV药物合理的给药方案。

1.8 联合治疗 参考HIV和HCV多靶点的治疗成功案例，抗HBV新药联合治疗方案目前已经被广泛接受，目前正开展不同研发阶段的临床研究。通常为HBV复制抑制剂(NAs、核衣壳抑制剂、病毒进入抑制剂)、降低HBV抗原相关新药(siRNA、反义RNA、核酸聚合物等)和抑制HBV相关的免疫激动剂(干扰素，治疗性疫苗，TLR7、8激动剂等)之间的组合。例如罗氏制药公司开展的NA+RG-6346(siRNA)+RO7049389(核衣壳抑制剂)组合和NA+RG-6346(siRNA)+RO7020531(TLR-7)组合。总之，Ⅰ期(早期)临床研究应关注人群的选择、研究设计、给药方案、剂量组的递增、不良事件/疗效的监测和分析。而Ⅱ～Ⅲ期临床研究则更关注疗效和不良反应的评估。

2 抗HBV代表性靶点治疗新药的临床研究

2.2 核衣壳抑制剂 核衣壳蛋白组装抑制剂通过阻断核衣壳装配过程，从而影响病毒复制和cccDNA补充，故其可作为抗HBV药物新靶点，且可以改善目前临床上NAs存在的耐药问题。核衣壳蛋白组装抑制剂分为两类，即诱导形成核衣壳碎片(Ⅰ类核衣壳蛋白抑制剂)或者形态完整的病毒核衣壳空壳(不含病毒基因组，Ⅱ类核衣壳蛋白抑制剂)。

莫非赛定的Ⅱ b期临床研究结果显示，治疗24周后，在初治队列莫非赛定联合恩替卡韦治疗组和恩替卡韦单药组中HBsAg下降的均值分别为0.69和0.40 log10IU/ml。在经治队列中，联合治疗组和恩替卡韦单药组的HBsAg下降均值分别为0.10和0.05 log10IU/ml。联合治疗组显示出较好的抗病毒治疗效果，且优于恩替卡韦单药组[12]。

AB-506是一款由 Arbutus Biopharma公司开发用Ⅱ类核心蛋白抑制剂。在AB-506首次人体临床试验中，血清HBV DNA几乎无应答，其与预先存在的I105T位点变异有关。体外细胞培养试验证实，T33N、T33S、I105T和T109S作为单点突变均可导致AB-506的EC50 发生2.5～356倍变化，从而导致临床试验失败。提示在后续开发新型衣壳抑制剂时，应尽早进行耐药性研究[13]。

2.3 靶向病毒mRNA的核酸干扰药物 反义寡核苷酸和RNA干扰(RNAi)都可以靶向HBV mRNA, 从而使靶蛋白的表达降低而发挥治疗作用。反义寡核苷酸主要依赖RNase H通路[14]。而RNAi是指由双链小RNA，包括小干扰RNA(siRNA)和微RNA (microRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象[15]。由于siRNA沉默病毒基因的特异性、高效性以及近年来药物投递材料的改进，使其成为研究的新热点。例如Arrowhead和Janssen公司探索了RNAi药物与核衣壳抑制剂的联合，在JNJ3989 (RNAi药物)+JNJ6379 (核衣壳抑制剂)+NAs的联合方案[16]治疗中，12例受试者达到了HBsAg降低超过1个log的目标。核酸干扰类药物进入机体后可能会刺激机体引起免疫应答、或者与内源miRNA存在竞争关系和脱靶现象，后续研究需要关注[17]。

2.4 HBsAg抑制剂 HBsAg抑制剂是一类核酸聚合物，具有广谱抗病毒活性，能抑制HBsAg的表达或者分泌[18-20]。Replicor公司开发的新药REP 2139和REP 2165是核酸聚合物，Ⅱ期临床结果显示其能产生功能性治愈(持续的HBsAg阴转)和从血液中持续清除HDV感染。REP 2139目前已经进入Ⅲ期临床研究。替诺福韦、聚乙二醇干扰素与REP 2139或REP 2165联用48周后，可使90%的受试者出现有意义的HBsAg下降(比基线水平下降大于10倍)，停药48周后，39%患者达到功能性治愈且伴随HBsAg血清学转换[21]。

2.5 免疫调节剂

适应性免疫应答，尤其是T淋巴细胞介导的细胞免疫应答对于控制HBV复制与CHB的进展至关重要。打破HBV免疫耐受，促进患者抗HBV免疫应答恢复成为CHB治疗的新突破点。

2.5.1 治疗性疫苗 在慢性HBV感染过程中，T淋巴细胞耗竭或者功能受到抑制导致病毒无法被清除[22]。治疗性疫苗通过特异性主动免疫，刺激CHB患者免疫系统，打破免疫耐受，清除病毒。治疗性疫苗包括含有或不含有佐剂的常规HBsAg疫苗、T淋巴细胞疫苗、HBsAg免疫复合物疫苗、DNA疫苗和表达HBV蛋白的病毒载体疫苗，例如T101、GS-4774等。高病毒载量会导致CHB患者免疫功能抑制[23]，因此降低病毒载量或体内抗原负荷后，接种治疗性疫苗，可能有利于激活机体免疫去抗病毒。然而，在ANRS HB02研究组开展的一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验显示，采用表达HBsAg的DNA疫苗联用NAs治疗48周后(DNA疫苗在0、8、16、40 和44周给药)，并没有降低NAs停药后HBV复发以及恢复抗病毒相关的免疫应答[23]。因此，如何提高HBV特异性免疫应答，并延长其应答时间，是治疗性疫苗研发过程需要解决的问题。

2.5.2 TLR激动剂 正大天晴和强生公司的TLR7激动剂JNJ-4964 (TQ-A3334) 正在CHB患者中开展临床Ⅱa期研究，结果尚未公布。但在健康受试者中进行的单剂量递增Ⅰ期临床研究[24]中，表现出了一定药效，包括ISG(MX1、ISG15、OAS1), IFNγ和IP-10等，提示其具有抗HBV的潜能。GS-9688(Selgantolimod)是选择性口服小分子TLR8激动剂，目前在CHB患者中开展临床Ⅱ期研究。在第24周，没有患者达到HBsAg水平下降≥1 log10IU/ml的主要终点，药效不明显[25-26]。

3 总结

目前靶向HBV生命周期各个靶点的新型抗病毒药物正在进行或即将进入临床试验，包括进入抑制剂、病毒转录抑制剂、核衣壳组装调节剂、HBsAg抑制剂和免疫调节剂等。然而采用何种策略的药物组合来抗HBV还需要临床试验去验证。借鉴HCV DAA药物成功的经验，多途径、多靶点、多药物联合阻断HBV的治疗方案可能成为实现HBV感染根治的重要途径。研发过程中的临床研究为研发的关键环节，根据药物作用机制选择合适人群、合理的给药方案、尽早发现药物的不良反应、探索待研究药物较其他抗HBV药物的优势，最终促进CHB得到治愈。

利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：张洪、丁艳华负责提出研究选题、撰写论文和修订论文；朱晓雪、买佳佳、陈红、周景、胡月、徐佳负责文献资料的检索和整理。