食管微生态与食管疾病

李东航 耿庆

既往研究认为，食管没有常驻菌的定植，仅为经口咽或胃来源的瞬时微生物，传统的培养法对大多数微生物菌群未能准确分离、纯化和鉴别，随着高通量测序和宏基因组学的发展，结合生物信息学分析，对微生态的研究已达到基因型分类水平[1]。尽管目前对肠道微生态已有了比较深入的研究，但对于食管微生态的认知仍然有限。作为一个新兴研究领域，本文对目前关于正常食管、胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)和Barrett食管(barrett's esophagus,BE)、食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)、食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)、嗜酸性粒细胞性食管炎(eosinophilic esophagitis,EoE)、食管动力障碍等食管微生态的组成及膳食和药物对其影响加以概述，为进一步理解食管微生态与食管疾病的关系及潜在诊疗策略提供新思路。

一、正常食管微生态

目前，对无症状的正常成人食管微生物菌群进行表征的研究尚未有统一的定论，但从这些研究中可以梳理出较为一致的结果，即正常食管存在以链球菌为主的复杂微生物菌群。Pei等[2]在2004年首次对正常食管远端黏膜行16S rDNA序列分析，发现其菌群主要包含6大门类，分别为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、梭杆菌门和TM7，其中链球菌属检出率最高，为39%，且菌群组成与口咽类似，但未检出到口咽包含的螺旋体门和杆菌门。Liu等[3]对正常食管远端微生物菌群组成的研究与Pei等结果一致。通过对7名健康成人的食管行分段高通量测序，我们发现链球菌属占据主导地位，食管上、中、下段常见微生物菌群没有显著性差异[4]。与Dong等[5]的研究结果一致，表明正常食管的微生物菌群组成相对保守，上、中、下段没有明显的微生态特异性。通过应用16S rRNA技术，Yang等[6]在一项大规模测序中首次将食管微生物组分为2种类型，I型主要分布于正常食管，以革兰阳性(G+)需氧菌为主，多由厚壁菌门、链球菌属构成；Ⅱ型主要分布于食管炎和BE，以革兰阴性(G-)厌氧菌为主，多由拟杆菌门、韦荣球菌属、普氏菌属、嗜血杆菌属等构成。这些研究表明，食管存在自身的微生态，其中链球菌属为优势菌群。

二、食管微生态与食管疾病

1.食管微生态与GERD和BE：GERD相关性食管炎和Barrett化生主要与从胃内慢性反流到食管下部的酸性物质(胃酸、少量胆汁)有关。在长期酸性环境的刺激下，导致食管黏膜损伤，从而产生炎性环境，其微生物的组成随之发生变化。Loris等[7]应用16S扩增序列分析了10例BE病人的化生黏膜和邻近正常黏膜，结果发现,前者α多样性降低，链球菌减少，拟杆菌、放线杆菌、普氏菌、韦荣氏菌增多，这种以革兰阴性菌为主的Ⅱ型菌群在BE中占比增多的现象，印证了Yang等[6]提出的食管菌群分类。除此之外，另外几项研究报道了在GERD和BE病人的食管菌群中，与正常对照组相比，弯曲杆菌属丰度均显著增加，并进一步表明弯曲杆菌属会引起前炎症因子白细胞(IL)-18升高，并介导TGF-β1下调，引起NF-κB、STAT3/SHH-BMP4轴/NOD2等细胞因子通路激活。其中，部分弯曲杆菌具有硝酸盐还原作用，并参与到EAC的启动和进展中[8-11]。然而，Yu等[12]在一项关于我国GERD病人食管菌群的调查中，仅发现菌群总体丰度和多样性的降低，但差异并无统计学意义。受地理环境、饮食习惯、个体差异、取样方式、样本量限制、测序技术等众多因素的影响，可能导致这一结果不尽相同。从技术层面更具信服力的是，Gall等[13]率先采用宏基因组测序揭示了厚壁菌门链球菌属和拟杆菌门普氏菌属在BE病人中为优势菌群，且二者比例与腰臀比呈正相关。厚壁菌门可以更有效地代谢短链脂肪酸、增加机体供能，促进宿主肥胖，而肥胖已被证实与人体GERD、BE和EAC的发生有关，尤其是中心性肥胖[14-17]。多项随机试验也表明，减轻肥胖可改善GERD症状，减少食管酸性环境的暴露[18-20]。这表明GERD、BE的发生伴随着微生物菌群的改变，尤其是肥胖病人，厚壁菌门的显著增加可能是其GERD、BE发生的危险因素之一。

尽管上述结果有所差异，但总体而言，与正常食管相比，GERD、BE病人的食管优势菌群具有从Ⅰ型向Ⅱ型菌群转变且菌群多样性减少的趋势[6,21]。反流造成酸性环境，使得更易耐酸的革兰阴性菌增多，而革兰阴性菌的外膜脂多糖(LPS)通过激活TLR4，诱导IL-1β 和 TNF-α产生，进而以直接和间接两种方式激活NF-κB炎性通路，并上调IL-8的表达，促使BE的发生；同时促进诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)的高表达，导致食管下端括约肌的松弛并延缓胃内容物的排空，促进了GERD的发生[14,21-22]。此外，在BE基础上，LPS也可通过TLR4通路激活炎性小体NLRP3，促进细胞凋亡和炎性细胞因子释放，塑造局部炎性环境，在长期慢性刺激下，细胞出现异性增生甚至恶变，进而进展为肿瘤[23]。

此外，一个有趣的现象是，尽管Hp被公认为是胃癌的I类致癌因子，但对于GERD病人来说，感染了Cag A阳性的Hp 却是一个保护因素，其不仅可降低GERD的严重程度，还可阻止食管黏膜的癌变[20,24]。一方面，Hp具有很强的耐酸性，在反流酸性的环境中占据优势地位，影响着其他微生物菌群的生长和组成，在Hp免疫应答的同时对其他致病菌具有交叉免疫效应；另一方面，Hp引起IL-8、IL-1β、TNF-α的产生，进而破坏胃泌酸细胞，降低胃酸的产生，对BE、GERD起到保护作用，减少了细胞恶变的发生率[25]。

2.食管微生态与食管癌：食管癌的发生是一个慢性渐进过程，尽管与吸烟饮酒等因素有关，但这些因素并不能用来解释全部食管癌的流行病学，如同理解结直肠癌多步骤模型一般，食管癌多从癌前病变的进展来揭示微生物菌群变化。具体而言，探究ESCC的微生态组成，揭示食管鳞状细胞不典型增生(ESD)就尤为重要。同样，探究从正常食管转变为EAC过程中微生态的变化就需要从GERD和BE的微生物菌群组成入手。

Yu等[26]的研究发现，食管微生物的多样性和ESCC、ESD之间存在负相关，Nasrollahzade等[27]进一步的研究表明，与对照组相比，ESD病人胃体微生物群中梭菌属和丹毒杆菌属更为富集，这与最近刘晓波等[28]和我们关于ESCC的研究结论相一致[4]。McColl等[29]对慢性萎缩性胃炎病人的研究中发现，其胃黏膜的微生态环境更利于产亚硝基细菌的生长，而硝酸盐的增加又反过来促进厌氧菌的富集，亚硝酸基的不断积累促进了ESD向ESCC的转变[29-30]。此外，有研究发现，与口腔疾病特别是牙周炎相关的福赛斯坦纳菌(T.forsythia)和牙龈卟啉单胞菌(P.gingivali)两种革兰阴性菌，可选择性地感染食管鳞癌黏膜和邻近组织，而不易感染正常对照组的食管黏膜[31-32]。尤其是P.gingivali，不仅与口腔鳞癌密切相关，也与ESCC的局部复发、淋巴结转移和总体生存率较低显著相关[33-34]。其具体机制为牙龈卟啉单胞菌通过促进Smads/YAP/TAZ/TEA域转录因子1(TEAD1)复合体的形成，启动下游靶基因表达、诱导上皮-间质转化(EMT)和维持肿瘤干细胞特性，增强ESCC细胞的增殖、迁移、侵袭和转移能力[34]。此外，P.gingivali的感染可激活自噬，诱导IL-6等促炎因子的表达，通过STAT3通路，促进肿瘤进展[35-37]。

有研究发现，不论是与正常食管，还是食管胃交界处腺癌相比，梭杆菌属在ESCC中显示出更高比例的富集，这种富集程度还与肿瘤的分化呈负相关[4，28]。其中，已被证实与结直肠癌的发生发展有着密切联系的具核梭杆菌，在ESCC瘤内的高丰度也与其不良预后、对新辅助化疗的不良反应密切相关，有研究表明，具核梭杆菌可作为食管癌潜在的预后标志物[38-40]。具核梭杆菌可通过激活CCL20等特定趋化因子，从而增强肿瘤侵袭，通过调节ESCC的自噬导致化疗耐药[41-42]。在未来，对于具核梭杆菌在ESCC中的具体分子机制研究、作为不良预后的微生物标志物及针对性抗生素干预策略的研究仍需要可靠的数据支持和临床验证。

对于EAC微生态的理解，除了上文提到的从GERD和BE层面的探究，在这两者转变为腺癌的过程中伴随着微生态变化的揭示也十分重要。与正常食管相比，BE的微生物菌群在组成上表现为链球菌的减少，普氏杆菌相应增加，而在EAC的微生物菌群组成上，这一改变更为显著，这也与EAC的发生通常是GER-GERD-BE-EAC这一渐进癌症模型不谋而合[7，13]。在GER相关炎症环境下，微生物的失调可诱导化生反应的增强，从而进展为BE和EAC。相比GERD和BE，EAC更加富集了耐酸菌，如发酵乳杆菌，乳酸的产生进一步改变了食管内环境，产生过氧化氢等有害物质，从而抑制其他细菌的生长，使得乳酸杆菌在食管下部成为优势菌群[43-44]。此外，核酸杆菌在EAC中也发挥着重要作用，其不仅可以黏附食管上皮，诱导炎性因子激活TLR4、NF-κB 炎性通路，还可抑制T细胞的免疫杀伤，产生免疫逃逸[7,45]。总体来说，EAC发生过程中，革兰阴性菌的增多和共聚集的产生，通过LPS激活天然免疫反应，刺激NF-κB的表达和炎性细胞因子的释放，同时拟杆菌通过代谢短链脂肪酸与提供CO2等因子协助其他厌氧菌的生存，维持BE向EAC转化的炎性环境和促瘤条件[21,46]。这与总体上食管癌微生物菌群的多样性降低，革兰阴性厌氧菌逐渐成为优势菌群的论断也相一致。然而，从BE到EAC的过程中，食管微生物菌群组成的改变并不显著，能够区分二者的特定菌群尚未可知，与这二者相关的菌群是BE或EAC的病因还是结果，如何在高危人群中寻找可作为早期诊断的生物标志物或作为亚型分类依据的菌属，及实施相应的微生物干预策略，仍需大样本的、质量可控的、更具信服力的研究。

3.食管微生态与EoE：EoE是一种以慢性免疫介导的食管功能障碍和食管黏膜产生嗜酸性粒细胞为主的炎性疾病[47-48]。有几项证据表明，先天免疫系统及微生物模式识别受体在EoE中发挥着潜在作用[49-50]。2015年Benitez等[51]对33例患EoE和35例不患EoE的儿童食管黏膜进行了16S rRNA测序表征，结果显示，两组食管菌群均以链球菌为主，进一步评估活动期和非活动期EoE病人的微生物组成，结果表明活动期EoE显著富集变形杆菌，而非活动期EoE和不患EoE的食管微生物组成没有显著差异。当然，这一研究存在着局限：取样时68例病人中66例正接受质子泵抑制剂的治疗，因此无法排除非EoE介导的食管炎的影响。另外一项内窥镜下调查EoE病人食管微生物群的前瞻性研究显示，与正常对照相比，EoE病人的总细菌负荷增加，嗜血杆菌丰度显著提升[52]。Benitez等[53]采用16SrRNA基因测序分别对活动期和非活动期EoE病人及非EoE对照组的食管微生物进行比较分析发现，链球菌属、普雷沃菌属和拟普雷沃菌属在三组食管活检组织中丰度较高，这种以链球菌属为主革兰阳性菌的高丰度，与之前在没有食管炎的成人和儿童的研究中结论一致[51,54-55]。与非EoE对照组相比，嗜血杆菌属的丰度从EoE的非活动期到活动期，呈现逐步增加的趋势，差异具有统计学意义[51,53]。此外，一项荟萃分析评估了11项的大样本观察性研究结果显示，与未暴露组相比，在Hp暴露下EoE的发生率降低了37%，食道嗜酸性粒细胞增多症的几率降低了38%，这可能与Hp诱导的免疫调节有关[56]。然而，前瞻性研究中很少得到Hp与EoE具有显著相关的结论，因此，Hp的作用仍需更多的证据。

总之，这些研究表明，EoE病人的食管微生物组成不同于正常食管黏膜微生态。而细菌负荷的增加可能并不是EoE直接影响的结果，因为随着防御素的释放，嗜酸性粒细胞具有细胞外DNA陷阱和抗微生物特性，局部环境的变化和菌群之间协作互存可能导致了细菌负荷的增加[57-58]。与GERD类似，EoE的微生物菌群显示出从革兰阳性菌向革兰阴性菌转变的趋势，考虑到革兰阴性菌在GERD中作用，我们推测嗜血杆菌和变形杆菌在EoE的嗜酸性粒细胞增多中发挥着潜在作用[6]。

4.食管微生态与食管动力障碍：目前还没有关于食管微生物群在食管动力障碍(如贲门失弛缓症)的详细报道，仅有少数研究提及了Chagas病和ESCC中伴有食管动力障碍时的微生物群组成[59-61]。一项关于继发于Chagas病的巨食管症病人的前瞻性研究，将食管抽吸物进行培养发现，与对照组病人相比，巨食管症病人具有更高浓度的细菌，尤其是硝酸盐还原相关的细菌更为显著[62]。此外的几项研究发现，贲门失弛缓症病人的ESCC发病率增加[43,61]。这种潜在的原因可能是食管腔内长期慢性炎症所致，食管下端括约肌功能失调改变了微生物菌群的生存环境。食管微生态与食管运动障碍之间相互作用的探究，对于揭示微生物群如何影响食管运动功能仍具有较高探索价值。

三、膳食与食管微生态

关于膳食对食管微生态直接影响的报道有限。一项对47例BE病人经内镜下活检行高通量测序的回顾性研究发现，膳食纤维摄入增加与厚壁菌门丰度升高和变形菌门比例减少有关，而脂肪膳食对食管菌群的组成没有显著影响[63]。然而，一项动物模型显示，高脂肪乳制品饮食较低脂肪组的动物有更高的BE和Barrette发育不良的发生率，并指出脂肪消耗过程中，胆汁内牛磺酸结合物浓度的增加可促进BE的发展[64]，高脂饮食可加速异型增生，并与食管组织中中性粒细胞和自然杀伤细胞比率增加有关[65]。另外，一项基于摄入食物频率问卷的研究显示，饮食中高摄入β-胡罗卜素与Barrette发育不良的风险呈负相关，高抗氧化指数得分与EAC风险呈负相关[66]。摄入大量精制糖等食物也会导致食管微生物群的改变，增加短链脂肪酸和胆汁酸的产生[67]。鉴于类似于肠道的能量代谢及食管肠上皮化生过程，影响这些代谢产物的食管微生物群可能也参与其中。

四、药物与食管微生态

抗生素、PPI、非甾体抗炎药和益生菌等药物也可影响食管微生物群组成，进而使机会致病菌或病原菌参与到食管疾病的发生发展中[3,68-69]。Sawada等[70]采用末端限制性片段长度多态性分析法，探究了EAC根治术后抗生素(青霉素、链霉素)对大鼠食管微生物组的影响，结果显示与对照组比较，抗生素组大鼠食管乳酸杆菌相对丰度降低，而梭状杆菌丰度显著升高。由于PPI的广泛使用，在早期食管微生态的研究中，多数并未排除PPI这一变量的影响。在Amir等[71]的研究中，调查了暴露于PPI前后的食管微生物菌群变化，在经过8周的兰索拉唑每天2次治疗后行食管活检，结果表明，在PPI暴露后，丛毛单胞菌科减少，而多种梭状芽孢杆菌增加。Deshpande等[72]采用两种测序方法对食管微生物组行代谢组学分析，发现PPI可使抗生素合成和产乙酸盐途径增加，进而影响食管菌群的生存环境。此外，有研究指出，在包括链球菌等细菌或真菌中，PPI可直接与三磷酸腺甙酶(ATP-ases)家族结合，改善机体能量代谢[72]。PPI对食管微生态的影响是多种机制的作用结果，尽管这些机制尚不清楚，但鉴于PPI的长期广泛使用，这种影响机制仍值得深入探索。毫无疑问，最近兴起火热的微生态制剂，也会不同程度地影响到食管微生态的组成，这种综合效应仍需进一步地评估。

五、展望

目前正常食管微生物菌群的组成已基本清晰，即由链球菌属为主导的复杂菌群组成，但涉及到地理环境、种族差异、饮食习惯等因素仍不能忽视。食管微生物菌群与食管疾病之间存在密切关联，但这种具体的因果关系、特定致病菌、潜在机制等仍需要大样本的宏基因组学分析及实验验证，进而寻求疾病的微生态靶点，更为精准地实施微生态靶向治疗。