Duchenne型肌营养不良症的治疗

罗 宏，岑海媚，罗 彬，张玉生，b，张 誉

(暨南大学附属第一医院 a.神经内科；b.脑血管病中心，广东 广州 510632)

Duchenne型肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是因编码抗肌萎缩蛋白的Dystrophin基因突变，导致进行性肌无力、肌肉萎缩的一种遗传性肌病，男性占多数，全球发病率为(10.7～27.8)/10万活产婴儿[1]。患儿常在2～3岁时出现临床症状，多数患者于12岁逐渐丧失行走能力，随病程进展逐渐累及膈肌及心肌，最终在20～30岁时死于呼吸衰竭或心力衰竭[2]。Dystrophin基因位于染色体X p21上，总长度约2.20×106bp，是目前为止发现的人类最大基因之一[3]。Dystrophin基因转录全长约427 k的dystrophin蛋白，后者是维系肌膜稳定性的关键蛋白，该蛋白缺失后导致肌膜稳定性破坏，肌肉收缩产生的机械应力无法被相关蛋白吸收导致肌肉炎症，进而激活肌细胞再生。最终, 反复修复再生的肌肉会被脂肪和纤维结缔组织取代，导致纤维化[4]。

迄今，DMD尚无切确的根治方法，但随着对该病发病机制和病理变化过程的认识不断深入，以及分子生物学和基因工程的快速发展，DMD治疗不断取得新进展。这些治疗方案主要围绕恢复dystrophin蛋白表达或弥补dystrophin蛋白缺失而进行。本文对DMD治疗的研究现状进行综述，并分析这些治疗方案的利弊，为临床医师治疗DMD提供参考。

1 恢复dystrophin蛋白表达治疗

DMD致病机制主要是功能性dystrophin蛋白缺乏，故最有效、最根本的治疗方法就是恢复dystrophin蛋白功能和表达。目前治疗方法主要有：通读疗法、外显子跳跃疗法、病毒载体介导的基因疗法、干细胞疗法，以及CRISPR/Cas9基因编辑疗法等。

1.1通读疗法 通读疗法是一种适用于大约10%无义突变患者的方法，运用药物诱导与核糖体结合，跳过识别提前出现的终止密码子，从而恢复全长、功能性肌营养不良蛋白的表达[5]。目前用于无义突变通读疗法的治疗药物主要有氨基糖苷类抗生素、Ataluren、RTCl3、RTCl4等，其中只有氨基糖苷类抗生素及Ataluren 进入临床试验阶段。(1)氨基糖苷类抗生素：庆大霉素为治疗DMD患者无义突变传统类药物，其与核糖体特定位点结合，诱导过早出现的终止密码子的通读，促进全长抗肌营养不良蛋白的转录表达。研究表明，用庆大霉素治疗的mdx小鼠(DMD模型鼠)肌膜中检测到肌营养不良蛋白的高表达，并且提高了肌肉收缩所诱导的损失抵抗力。然而在人体试验却得到了矛盾的结果。Malik等[6]采用3种不同的治疗方案验证了静脉注射庆大霉素治疗DMD患儿无义突变的疗效，观察周期为6个月。结果显示，接受庆大霉素6个月治疗的患儿抗肌营养不良蛋白的表达增加，血清肌酸激酶(CK)水平降低，但反应肌肉功能质量改善的指标却没有改变，需要更高的剂量才能改善患者的结果。此外，庆大霉素的耳毒性及肾毒性也限制了其在治疗DMD方面的长期应用。为此，目前有研究开发出了氨基糖苷类衍生物NB74和NB84，已经在体外测试证明了其在细胞毒性和通读效率方面优于庆大霉素。另外一种氨基糖苷类抗生素硫酸阿贝卡星(NPC-14)Ⅱ期临床试验(试验编号：NCT01918384))目前已完成，但尚未公布结果。(2)Ataluren：Ataluren(PTC124)是目前研究最多、最有希望的抑制无义突变的通读治疗药物。在一项为期28天的Ⅱa期研究中，DMD患者在治疗后显示Ataluren 能增加11%抗肌萎缩蛋白的表达[7]。随后的一项为期48周双盲安慰剂对照的Ⅱb期研究中，Bushby等[8]采用两种不同的治疗方案治疗174名无义突变的DMD患者，其中方案一：每天口服Ataluren 3次(10、10、20 mg/kg，分别是早上，中午和晚上剂量，n=57)；方案二：每天口服Ataluren 3次(20、20、40 mg/kg，分别是早上，中午和晚上剂量，n=60)，对照组(n=57)予安慰剂治疗。结果显示，与安慰剂相比，每天服用40 mg/kg Ataluren的治疗组在平均6 min步行测试(6MWT)距离上比安慰剂组增加了30 m，然而在每天服用80 mg/kg的治疗组却看不到症状的改善，这种结果可能归因于Ataluren的钟形剂量效应曲线。基于这些结果及相关研究，Ataluren于2014年获得欧洲药品管理局(EMA)条件性批准，但却没有获得美国食品与药品管理局(FDA)批准。原因是Ataluren Ⅱb期研究及Ⅲ期研究(试验编号：NCT01826487)未能达到主要终点事件。由于2017年Ataluren的Ⅲ期研究显示阿塔鲁仑治疗组和安慰剂对照组之间的6MWT差异无统计学意义[9]，PTC Therapeutics公司被要求在2021年之前进行一项新的验证性研究来确认临床疗效。Ataluren主要用于治疗≥5岁的无意义突变的DMD患者[10]。2018年，EMA在审查了该药对治疗2～5岁患者安全性数据后，批准将Ataluren治疗的适应证扩大到≥2岁患有无义突变的DMD患者[9]，近期一项评估Ataluren治疗6个月～2岁的无意义突变的DMD患儿安全性的试验(试验编号：NCT04336826)正在进行，期待获得预期的疗效和安全性。虽然Ataluren有很好的治疗前景，经Ataluren治疗的DMD患者活动阶段可能延长5年，但Ataluren治疗只适用于约13%携带无义突变的DMD患者，而且这种药物价格昂贵，未来在临床上普及需一段时间。

1.2外显子跳跃疗法 缺失突变是肌营养不良常见的突变类型，约占所有DMD突变的68%[11]，缺失突变包括移码突变和整码突变。Becker肌营养不良症(becker muscular dystrophy, BMD)是肌营养不良的一种症状相对较轻的临床表型，其特征是框内整码突变但不破坏阅读框(ORF)，因此可以产生部分截短的功能性蛋白。而DMD是由于框内移码突变破坏阅读框，导致dystrophin蛋白的缺失。基于这种阅读框架假说，科学家提出了外显子跳跃这一概念。外显子跳跃疗法是通过合成的反义寡核苷酸(ASO)序列在DMD基因的前信使RNA剪接过程中诱导预先指定的外显子跳过，将严重DMD表型改善为临床症状较轻、预后较好Becker肌营养不良症。大约90%的DMD患者的dystrophin基因缺失可以通过跳过多个外显子治疗而症状改善[12]。目前进入临床试验的反义寡核苷酸药物有Drispersen、Eteplirsen、Golodirsen等，几种不同的化合物在不同的DMD动物模型中进行了测试，并且在Ⅱ期临床试验中显示了令人满意的结果。

Drispersen(2′O-methyl-ribo-oligonucleoside-phosphorothioate，2′OMePS)是基于2′-O-甲基硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸，是第一个在DMD患者身上测试的寡核苷酸，旨在跳过51号外显子。在Drispersen的一项Ⅲ期研究中，涉及186例DMD患儿，其中治疗组125例接受每周6 mg/kg的Drispersen皮下剂量，对照组61例接受安慰剂治疗，遗憾的是虽然治疗组的疗效优于安慰剂组，但未能证明6MWT差异有统计学意义或临床显著改善，同时治疗组还观察到注射部位炎症反应、蛋白尿、血小板减少[13]，因此FDA拒绝了Drispersen的上市批准申请，关于Drispersen的开发研究也于2016年终止。

Eteplirsen(phosphorodiami-date morpholinooligomers, PMOs)是一种吗啉反义寡聚物，通过特异性跳过外显子51来恢复DMD基因的翻译阅读框架，从而促进缺陷遗传变异体中营养不良蛋白的产生。2016年，基于Eteplirsen Ⅱ/Ⅲ期临床研究的结果，FDA有条件的批准对DMD患者进行这种治疗[14]，但由于参与临床试验的患者数量较少，Eteplirsen的临床疗效需要更多的研究来进一步验证。

最近，在Ⅰ/Ⅱ期试验和正在进行的Ⅲ期试验取得积极结果后，FDA批准了另一种药物Golodirsen, 适用于治疗8%外显子53顺应性突变的DMD患者[15]。Golodirsen是设计用来跳过外显子53的寡核苷酸，在前期研究中已经发现患者抗肌萎缩蛋白表达增加，目前Ⅲ期临床试验(试验编号：NCT0250038l，NCT03532542)正在进行中。

尽管反义寡核苷酸介导的外显子跳跃疗法有着良好的治疗前景，但这种治疗策略也存在明显的局限性：(1)疗效有限，细胞摄取率低，不能有效的输送到靶组织，无法恢复心肌中dystrophin蛋白的表达。(2)由于反义寡核苷酸药物分子较小，会通过肾脏快速排泄。(3)外显子跳跃疗法旨在将DMD表型转为临床症状轻微的BMD表型，不能完全治愈DMD患者。(4)由于反义寡核苷酸药物在血液中的半衰期短，需要重复给药才能维持治疗效果[16]。(5)治疗个体化，只针对特定类型的外显子跳跃突变，例如Drispersen和Eteplirsen只能治疗约13%的51号外显子突变的患者[17]。

为了解决外显子跳跃的局限性问题，科学家们研究了一系列新的治疗策略。在这些策略中，为了解决反义寡核苷酸药物循环系统清除快的问题，相关研究采用硫代磷酸酯(PS)修饰的反义寡核苷酸与血浆/血清蛋白结合，降低其肾脏清除率，并增加其在组织中的蓄积，特别是肾脏和肝脏，从而大大降低反义寡核苷酸药物在循环系统的清除率[18]。此外，在克服外显子跳跃疗法心肌疗效低问题上，有研究已经开发出一种肽缀合的多肽偶联吗啉代寡聚物(PPMO)，这种寡聚物富含精氨酸，具有良好的药代动力学特征，能够增强细胞的摄取，已经在细胞和动物实验上证实了在细胞稳定性及细胞转导效率方面优于PMO[5]，但该药在非人类灵长类动物的安全性评估中，结果揭示低剂量导致了严重的肾脏毒性[19]，因此在进入人体临床试验阶段之前还需要更多研究来进一步验证其安全性。

1.3病毒载体介导的基因替代疗法 基因替代疗法是一种能治愈DMD的疗法，通过病毒载体将外源性修饰过的功能基因导入宿主体内，置换突变基因并恢复抗肌萎缩蛋白表达。腺相关病毒(adeno-associatedvirus, AAV)是DMD治疗最常用、最有希望的载体，具有致病性低、免疫原性低、外源基因可在宿主内长期表达等优点[20]。DMD基因是人类最大的基因之一，总长度约2.3 Mb，dystrophin cDNA 约14 kb，两者长度都远超过了腺相关病毒5 kb的最大承载能力[21]。于是，有研究通过创建微型或小型抗肌营养不良蛋白解决这个问题。在一项研究中，将携带mini/micro dystrophin的AAV载体注射到DMD模型犬中，结果显示了肌肉组织学的改善[22]，然而，在一项对6名注射了AAV相关的微型抗肌营养不良蛋白基因的DMD男孩的研究中，由于对微型抗肌营养不良蛋白产生了T细胞介导的免疫反应，转基因表达没有成功[23]。目前，着眼于开发一种重组腺相关病毒载体(NCT 03368742)和更有效的载体传递系统的研究正在进行中。

1.4CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑治疗 CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术是近几年研究的热点，同时也是一种充满希望的治疗方法，因为它从根本上永久纠正DMD患者的基因缺陷，达到治愈DMD的效果，同时也将DMD患者长期治疗成本降至最低。Ousterout等[24]的研究中用SpCas9将针对DMD内含子44和55的gRNA电穿孔于1例外显子48-50缺失的DMD患者的永生化肌肉细胞中，证实了gRNAs可以有效地删除DMD基因中的单个或多个外显子。另外一项研究中，Young等[25]采用CRISPR/Cas9系统介导的外显子跳跃疗法在HiPSC中实现了45-55号外显子的跳跃。值得注意的是，DMD基因中缺少该外显子45-55区域的患者通常是无症状的或者表现为轻微的表型[26]，因此治疗45-55号外显子的DMD患者具有重要的临床意义。

基因组编辑是一种特定于突变的方法，这意味着必须针对不同的突变专门设计和优化引导RNA。另外，基因组编辑方法也可能会出现脱靶效应，这会导致DNA的永久性改变。未来需要进一步深入了解基因组编辑的非靶点效应的机制和频率，以充分阐明相关的安全问题。

1.5干细胞疗法 干细胞疗法基于干细胞的异体或自体移植，目的是重建肌肉卫星细胞库，恢复肌营养不良蛋白的表达。治疗的干细胞的来源可以是健康的、组织相容的捐赠者，也可以是经过基因校正的自体细胞。目前已经有许多类型的干细胞应用于DMD动物模型并取得了预期的结果，这里我们主要介绍几种近几年兴起的、充满希望的干细胞疗法。

利用HiPSCs基因工程恢复dystrophin蛋白的功能性表达治疗肌营养不良是充满希望的治疗方法。iPSCs细胞构建是通过将携带有4种转录因子(OCT3/4、SOX2、KLF4和c-MYC)的相关病毒转导入人类体细胞(如皮肤或血液细胞)中使之发生重编程，从而获取与胚胎干细胞相似潜能的诱导多潜能性干细胞[27]。为了产生表达dystrophin的肌纤维，可以对来自DMD患者的hiPSCs进行基因编辑，使其表达功能性dystrophin蛋白，以用于自体细胞替代治疗。理论上，基因编辑联合干细胞疗法可以纠正大多数DMD突变，永久修复DMD基因，Young等[25]在免疫低下的mdx小鼠中移植来自基因校正的DMD-hiPSCs，结果成功恢复了dystrophin蛋白的表达证实了这一理论的可行性，然而目前还没有基因编辑的iPSCs用于细胞移植治疗的临床试验。在进入临床试验前还需要克服几个关键限制因素：(1)需要找到DMD患者产生HiPSCs的最佳体细胞类型，优化培养条件，以避免在生产过程中细胞在体外分化。(2)需要优化干细胞的输送途径，提高干细胞的移植效率，动脉移植可以可以绕过肺屏障，但安全性需要更多研究验证[28]。(3)Cas9的非靶点效应以及在接受治疗的患者中潜在的肿瘤或畸胎瘤形成的风险。

鉴于干细胞疗法的局限性，有研究者开发了一种嵌合细胞(DEC)疗法，通过将供体肌母细胞和受体肌原细胞在体外融合获得嵌合细胞，然后在免疫抑制下移植到mdx小鼠中, 结果显示，mdx小鼠的肌营养不良蛋白的表达显著提高(超过37.27%)，以及肌肉功能的改善[29]。嵌合细胞治疗因为携带自体细胞，可以减少免疫反应的发生，能延长移植物的存活时间并且不针对特定的基因突变，因此嵌合细胞疗法将是未来治疗DMD非常有吸引力的潜在治疗方法。

2 弥补dystrophin蛋白缺失的治疗

尽管DMD是一种单基因疾病，但dystrophin蛋白的缺失会触发多种病理表现，包括炎症、钙稳态丧失、功能性缺血和肌肉再生受损等。因此针对DMD继发性病理表现，采用弥补dystrophin蛋白缺失的治疗可以延缓DMD疾病进程，提高患者的生活质量，这对DMD患者具有重要的临床意义。

2.1抗氧化剂与抗炎药 皮质类固醇(如强的松、强的松龙和地夫可特)是DMD的标准治疗方法[1]。虽然皮质类固醇延缓了DMD的进展，但长期使用会引起包括体重增加、发育迟缓、胰岛素抵抗、骨质疏松症和行为改变等不良反应[30]。Vamorolone(VBP15)是一种糖皮质激素类似物，与糖皮质激素作用机制相似，但不良反应较少。Vamorolone的Ⅱb期研究表明了其具有抗炎作用，并且不会引起与皮质类固醇不良效应相关的生物标记物的改变[31]。最近对48名患有DMD的男孩(4～7岁，初次使用类固醇治疗患者)进行的最新研究结果显示，在24周的治疗期内，每天服用不同剂量(2 mg/kg和6 mg/kg)的显示炎症反应减少，且没有观察到严重的不良反应[32]。虽然Vamorolone的安全性优于糖皮质激素，但在使用高剂量组的患者中也出现了体重增加的不良反应，因为目前没有这种药物长期治疗效果的数据，导致相关的不良反应可能未观察到。值得注意的是，Vamorolone作为一种盐皮质激素受体拮抗剂和糖皮质激素受体激动剂，它也可能起到心脏保护作用[33]。

2.2Utrophin调节 抗肌萎缩蛋白相关蛋白(Utroin)是dystrophin结构上(同源性80%)和功能上类似的结构蛋白，通过上调这些蛋白质的表达可以缓解DMD[34]。Ezutromid(SMT C1100)是一种口服生物分子，通过靶向utrophin-A启动子以增加utrophin表达。Ezutromid(SMT C1100)及其相关化合物SMT022357都在临床前实验中被证明可以增加utrophin的产生，缓解肌营养不良症进程。然而该化合物的Ⅱ期试验因未显示出疗效而终止研发[35]。

2.3组蛋白去乙酰化酶抑制剂 组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂是一类能改变组蛋白表观遗传标记，从而影响多个基因表达的化合物。HDAC抑制剂的作用机制主要是通过促进一些肌肉再生因子(如卵泡抑制素)的转录，在体外刺激肌肉生成，对抗mdx小鼠的肌肉退化。Givinostat是一种HDAC抑制剂，具有抗炎、抗纤维化和促再生基因表达的作用[36]。Givinostat的Ⅲ期试验(NCT03373968，NCT02851797)目前正在进行中，希望能得到预期的疗效和结果。

2.4他汀类药物 2015年，Whitehead等[37]描述了他汀类药物对治疗mdx小鼠的积极作用，吸引了众多研究者的眼球。与长期服用他汀类药物引起骨骼肌病和横纹肌溶解的结果不同，每天服用适量(5～10 mg/kg)辛伐他汀可明显减轻炎症、纤维化、氧化应激和改善肌力。此外，辛伐他汀治疗还可以减轻DMD进展过程中的骨骼肌自噬[38]。然而，在一项评估他汀类药物治疗相关肌病风险的荟萃分析显示与服用安慰剂的患者疗效相比没有差别[39]，出现这种差异的原因可能是服用他汀类药物的人群大多为老年患者，运动以及女性患者因素[40-41]也可能增加药物不良反应的风险，未来还需要更多研究证实他汀类药物治疗DMD的安全性。

综上所述，恢复肌营养不良蛋白的表达是治疗该病主要治疗目标，为了达到对DMD患者的理想治疗，我们需要联合不同的治疗策略，针对不同的疾病过程采取多种干预措施。基因编辑技术联合干细胞疗法是目前前景最好和充满希望的治疗方法，但要转化到临床试验阶段还需要克服很多的困难，如何解决CRISPR-CAS9系统脱靶效应的问题以及构建理想的移植细胞是我们值得思考的问题。目前已经有一系列的动物实验甚至临床试验取得了令人鼓舞的结果，相信不久的将来DMD能够得到有效的治疗。