骨髓干细胞移植治疗急性心肌梗死的研究进展

卢文燕，张 明

(1.南昌大学研究生院医学部2018级；2.江西省人民医院全科医学科,南昌 330006)

急性心肌梗死(AMI)是在冠状动脉粥样硬化病变的基础上，因冠脉管腔内血栓形成，造成急性冠脉闭塞，相应心肌细胞供血中断，导致心肌细胞严重而持久的急性缺血性坏死。为了尽快使闭塞的血管再通，再灌注治疗已成为目前治疗AMI的重要紧急措施。再灌注治疗方法包括溶栓治疗和急诊经皮冠状动脉介入治疗(PCI)，但由于急诊PCI在基层医院可能并未开展或者技术不成熟，导致患者转入上级医院时已经造成部分心肌细胞缺血坏死，而溶栓治疗又有其适应证、禁忌证，部分患者不宜进行溶栓治疗，同样造成心肌梗死。其中更有部分急性期患者因未能及时疏通或重建血运而迅速造成大面积心肌梗死，心脏为维持其泵血功能，发生退行性左室重塑，甚至形成室壁瘤，最终导致心功能不断恶化而心力衰竭。以往认为成熟的心肌细胞缺乏再生能力，心肌梗死发生后，梗死区心肌只能通过纤维增生，由无收缩功能的疤痕组织代替。因而即使恢复或重建血运通路，也不能从根本上修复坏死心肌组织。心肌梗死后在梗死灶周边及正常的心肌组织中也有少量心肌细胞发生有丝分裂，以增殖修复受损的心肌组织。而TAKAHASHI等[1]的研究表明骨髓单个核细胞(MNCs)培养液能产生多种细胞因子，这些细胞因子通过直接保护心肌细胞，增强心肌的收缩能力，抑制心肌细胞的凋亡，诱导梗死灶周围微血管生成，从而促进梗死心脏功能的改善。

干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有分化成各种细胞、组织、器官的潜在功能。根据来源不同，分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞面临细胞标本短缺、免疫排斥、伦理道德等方面的问题，使之应用受限。骨髓干细胞(BMCs)属于成体干细胞，目前认为其主要包含以下两类干细胞：骨髓间充质干细胞(MSCs)和造血干细胞。由于骨髓干细胞通过温和的机械分离即能制备单细胞悬液，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，来源广泛，且可自体移植，受到广大学者的青睐。骨髓干细胞能分化为心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞及多种细胞因子等。因此，通过干细胞移植阻止心脏衰竭的恶化进程甚至去恢复心肌损伤患者的心功能，给心肌梗死的治疗开辟了一个崭新的前景。本文就干细胞移植治疗急性心肌梗死的作用机制、研究状况、存在的问题及前景进行综述。

1 作用机制

1.1 干细胞分化成心肌细胞

早在1999年TOMITA等[2]研究表明，体外培养中，5-aza培养的BMCs可形成肌钙蛋白Ⅰ和肌球蛋白重链染色阳性的肌小管；体内研究中，将BMCs移植到冷损伤性心脏痕组织中，8周后检测也可见心肌样肌细胞，肌球蛋白重链和肌钙蛋白Ⅰ染色阳性，心脏功能较前显著改善。SZARAZ等[3]利用qPCR技术分析体外培养基cTnT和MYH6基因表达水平，结果发现实验组cTnT mRNA水平高于对照组，MYH6 mRNA的表达在干细胞分化过程中也被强烈诱导。并采用流式细胞术分析心源性分化标记物，结果显示心肌细胞标记信号调节蛋白α和缝隙连接蛋白43(Cx43)的表达水平高于对照组，表明间充质干细胞能分化为功能性心肌细胞样细胞。

1.2 干细胞旁分泌机制产生多种细胞因子

TAKAHASHI等[1]在研究中发现BMCs无论是在缺氧还是常氧条件下均能明显抑制成龄大鼠心肌细胞的凋亡，同时增加梗死后心肌微血管的密度，缩小纤维瘢痕的面积，明显提高心脏的功能。他们收集BMCs的培养液做ELISA和Western bloting分析，发现BMCs产生了多种细胞因子(包括VEGF、IL-6、PDGF、IGF-1)，其中一些在缺氧的条件下是明显增加的。研究表明BMCs产生的细胞因子增强了心肌细胞对抗缺血损伤的能力，诱导了血管的新生，抑制了梗死心脏的重构，这对干细胞移植治疗心肌梗死意义重大。TANG等[4]对心肌梗死小鼠进行自体MSCs移植，2个月后发现小鼠梗死区毛细血管密度增高，VEGF表达明显升高，心肌细胞凋亡减少，心功能明显改善。其可能机制为MSCs在损伤区域可以自身分泌和上调周边细胞表达多种细胞活性因子；MSCs自我更新能力能维持长期的血管再生状态。

1.3 干细胞减少炎症因子

LUGER等[5]将小鼠左前降支阻断45 min，在心肌梗死后24 h，实验组静脉注射2×106MSCs，对照组注射生理盐水，每组各16只，21 d后，发现MSCs组明显降低心脏和脾脏的自然杀伤细胞和心脏的中性粒细胞。研究发现心肌梗死前24 h特异性自然杀伤细胞耗竭可改善梗死面积、左心室射血分数、左室重构及减少心脏中性粒细胞。这表明MSCs通过全身抗炎作用改善急性心肌梗死的左心功能障碍。

1.4 干细胞外泌体发挥重要作用

干细胞分泌的胞外小泡有刺激血管生成，保护细胞，调节细胞凋亡的作用。DOUGHERTY等[6]从人类诱导的多能干细胞源性心肌细胞(hiPSC-CM)培养基中分离出分泌颗粒，并用射透电镜、纳米粒子追踪分析、免疫印迹证实了分泌颗粒的大小和形态与外泌体一致。此外，在研究外泌体对牛主动脉内皮细胞(BAEC)的管壁形成、伤口愈合和细胞增殖的影响时发现，与对照组(NO-Exosomes)相比，100 μg·mL-1CM-ES处理的BAEC在管壁形成、伤口愈合和细胞增殖方面均有显著提高。结果表明，从hiPSC-CM中分离出的Exosomes能促进血管内皮细胞生成和细胞增殖。该研究阐明了干细胞移植治疗心肌梗死新的作用机制，为疾病的治疗提供了新的理论基础。

2 基础与临床研究现状

2.1 基础研究

LUO等[7]为了解决干细胞生长、保存和运输的问题，将人骨髓间充质干细胞分泌因子包装成聚乳酸-乙醇酸微粒子，然后包被MSC膜，形成非物理粒子合成MSC(或synMSC)，结果发现，synMSC显示出与真MSC相似的因子释放谱和表面抗原，并能发挥MSC的促进心肌细胞和血管再生的功能及显示低温环境下体外或体内保存和冻干稳定性。LUGER等[5]对鼠的研究发现注射生理盐水对照组左室重构不良，左室射血分数恶化，而静脉给予间充质干细胞实验组消除了左室舒张末期容积和左室收缩末期容积的恶化，另外在缺血性心肌病模型中，心肌梗死后4周给予小鼠(n=16)尾静脉注射2×106MSCs，第3周重复注射，与对照组(n=16)相比，骨髓间充质干细胞组左室射血分数明显增加，左室收缩末期容积减少。MENG等[8]将白介素10(IL-10)基因通过转录激活物样效应核酸酶(TALEN)整合到羊膜间充质干细胞(AMM)基因组中，并翻译成IL-10基因编辑的羊膜间充质干细胞(AMM/I)，将AMM/I移植到AMI小鼠模型中，发现AMM/I移植可明显抑制CD68阳性或F4/80阳性的浸润性炎症细胞，降低梗死心肌中促炎因子的表达。此外，还发现，采用AMM/I移植的小鼠心肌细胞周围毛细血管密度明显增加，梗死面积明显缩小，左室功能得到改善，并且AMM/I对心肌细胞凋亡具有高度抑制作用。此项研究表明，AMM/I移植通过抑制细胞炎症、增加毛细血管密度、抑制细胞凋亡等方面的作用，对左心室功能的早期恢复和重构发挥了良好的作用。然而移植的细胞在缺血缺氧环境下存活不良会降低其治疗效果。Follistatin-like 1(Fstl1)是一种新型促生存的心肌因子，在缺血环境中对细胞具有保护作用。SHEN等[9]将骨髓间充质干细胞在缺氧条件下模拟心肌缺血环境，分别于缺氧后0、24、48 h检测Fstl1的表达，在低氧处理48 h后，进一步收集间充质干细胞进行细胞死亡和增殖试验，结果发现Fstl1在缺氧间充质干细胞中的表达呈明显的时间依赖性下降，体外研究进一步证实Fstl1促进缺氧间充质干细胞的存活和增殖。因此可以推测，Fstl1可以显著延长MSC植入人体后的存活时间。同时他们将MSCs(MSCs-mcherry)或Fstl1过表达MSCs(MSCs-fstl1)注入小鼠梗死周围区，在治疗后1、3、7 d对供体细胞的保留情况进行评估，并计算梗死面积、梗死心脏的新生血管及心肌功能。结果发现MSCs-fstl1组显著延长供体细胞的存活时间，并且通过限制瘢痕形成、减少炎症反应、增强新生血管，明显改善心肌梗死后的心功能。这表明fstl1是一种促进骨髓间充质干细胞存活和增殖的内源性心脏因子，可以优化骨髓间充质干细胞移植的治疗效果。

2.2 临床研究

KIM等[10]进行的一项随机对照临床试验，将26例急性ST段抬高型心肌梗死PCI术后患者分为骨髓间充质干细胞(BM-MSC)组(n=14)和对照组(n=12)，对照组在梗死后给予常规治疗，BM-MSC组在PCI术后1个月冠状动脉内注射自体骨髓间充质干细胞，并给予常规治疗。观察左室射血分数(LVEF)从基线到随访4个月后的变化。通过SPECT测定，BM-MSC组LVEF较对照组明显增加。通过超声心动图测定，随访4个月时LVEF增加幅度细胞组显著高于对照组[(9.0±4.7)%比(5.3±2.6)%，P=0.023]。在整个研究过程中，细胞移植并未增加不良临床事件、支架内再狭窄或心律失常风险。LI等[11]进行了一项80例患者参与的随机对照试验，在成功完成再灌注治疗后1个月，经冠状动脉注入骨髓间充质干细胞至梗死相关动脉，随访6个月后发现，骨髓间充质干细胞组LVEF的改善幅度明显大于对照组[(5.9±8.5)%比(1.6±7.0)%，P=0.037]，在治疗过程中，未发现干细胞治疗相关毒性，随访期间无明显不良心血管事件发生。可见，冠状动脉内灌注骨髓间充质干细胞是安全有效的。张艳平等[12]将8项随机对照临床试验共410例纳入荟萃分析，结果显示在有效性方面，移植后3、6、12个月，移植组左室射血分数均较对照组明显增加，差异有统计学意义；在安全性方面，移植组和对照组差异无统计学意义。肖文涛等[13]进行的一项自体MNCs、MSCs经梗死相关冠状动脉(IRCA)内序贯移植治疗AMI的临床研究，分别于移植后3、6个月测定LVEF和心肌灌注缺损面积百分数，结果显示移植组LVEF和心肌灌注缺损面积百分数均较对照组明显改善，且2组恶性心血管事件发生率差异无统计学意义。

然而LAGUNA等[14]选用LVEF低于50%，有冠脉搭桥(CABG)适应证的20例透壁性心肌梗死患者进行随机对照试验，在急性心肌梗死后第10—15天，干细胞组在体外循环下采用心肌内直接注射骨髓单个核细胞(MNCs)，对照组仅行CABG治疗。术前、术后9个月行钆磁共振成像及应激性超声心动图检查。最后17例患者完成随访，分析研究结果，在2组基线特征基本一致的前提下，2组LVEF变化幅度、整体室壁运动减低水平或局部室壁运动减低水平、舒张末期容积下降幅度或收缩末期容积下降幅度比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。此项研究结果表明，AMI患者在冠脉搭桥时心肌内注射MNCs对心室重构及心脏功能无中—远期改善作用。另外NICOLAU等[15]的随机对照临床试验也得出相似结论，即冠状动脉内灌注MNCs并没有改善左心室重构或减少梗死面积。但从具体数值上分析，在LAGUNA等[14]的研究细胞组的指标除局部室壁运动减低水平外，其余指标均优于对照组，且该研究样本量少，用于结果分析的仅17例，这可能影响试验结果的说服力。所以需要开展更多大样本、多中心、双盲、随机对照试验来进一步证实。综合分析以上研究，不难发现各方研究者利用的移植时间、移植途径、细胞种类、细胞数量、患者初始左室射血分数不一，造成研究结果不尽相同。在今后通过控制这些可控因素，将干细胞联合某种或多种细胞因子整合到生物材料中，以期寻找一种最优化组合，为临床应用干细胞治疗心肌梗死提供强有力的治疗方案。

3 存在的问题

3.1 干细胞归巢率、分化率差

骨髓间充质干细胞是心肌细胞修复和再生的种子细胞，但其归巢率和分化率差，不能最大程度分化成心肌细胞，在临床应用中受到了一定的限制。YANG等[16]研究发现超声靶向微泡破坏介导的趋化因子 12(CXCL 12)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)共转染能显著促进干细胞移植后梗死心肌的修复和再生；LU等[17]的研究也表明间充质干细胞通过CXCL 12趋化途径向梗死灶周边招募常驻心脏内皮细胞，从而改善AMI小鼠模型的心脏功能，其中CXCL 12是归巢因子，BMP 2是促分化因子，但是两种因子以何种比例联用才能达到更好的治疗效果，还需要更多高质量的基础研究及临床研究来证实。

3.2 移植细胞存活率低

梗死区缺血缺氧和炎症状态会促使移植细胞死亡，从而降低干细胞对缺血性心脏病的治疗效果。Bcl-2是细胞凋亡中最受关注的癌基因之一，它具有抑制凋亡的作用。LI等[11]使用Bcl-2基因对MSCs进行基因改造，组装成Bcl-2过表达MSCs，将Bcl-2-MSCs或单纯MSCs移植到心肌梗死大鼠中，与MSCs组相比，Bcl-2-MSCs组在移植后4 d、3周和6周时细胞存活率分别增加了2.2倍、1.9倍和1.2倍。KITABAYASHI等[18]对梗死大鼠的研究发现，Bcl-2修饰的骨骼肌成肌细胞组移植细胞存活时间延长，心肌纤维化减少，梗死区和边缘区血管密度增加，心功能明显改善。2项研究都支持Bcl-2能够提高移植细胞抵御心肌梗死区恶劣环境的能力，但仅限于动物研究，在人体中是否有效还有待考证。

3.3 干细胞的增殖分化需要强化

单纯的细胞移植后其转分化率及表达结构功能的程度并未达到人们的预期理想，因此人们开始倾力于对细胞的增殖分化有促进作用的生长因子的研究。CHANG等[19]在左前降支闭塞的Sprague-Dawley大鼠心肌梗死模型中发现，移植后12周，脂肪源性成人干细胞联合生长因子复合物(ADAS-GFS)移植组与ADAS移植组或对照组比较，ADAS-GFS移植组梗死区周围毛细血管增多，左心室功能明显改善，与ADAS移植组或对照组比较差异有统计学意义，这些数据表明生长因子能够提高干细胞向血管内皮细胞分化的潜能。然而生长因子由于其易弥散而不能持久作用，以及如何与微环境中的移植细胞达到最有效的生物性结合又成为研究中悬而未解的问题。

3.4 干细胞治疗的安全性问题

不少研究发现干细胞治疗存在安全隐患。GLEESON等[20]在全枸橼酸血中添加间充质干细胞后发现可增强动脉剪切时血小板在胶原蛋白上的血栓沉积，肝素联合用药可消除这一效应；在猪急性心肌梗死模型中，在再灌注期间注入25×106间充质干细胞后，冠状动脉血流减少，联用肝素可消除该效应，说明MSCs有形成血栓的前活性，这对于心肌梗死患者来说是非常不利的。SIMINIAK等[21]将10例患者的自体骨骼肌成肌细胞在体外培养3周后进行移植，术后早期2例出现持续性室性心动过速，其余2例随访2周后发生持续性室性心动过速。还有学者认为干细胞移植会导致肿瘤发生。GAO等[22]在临床研究中发现1例患者在注射细胞的过程中发生严重的冠状动脉阻塞并发症；LALU等[23]进行的荟萃分析共收集了668项研究，其中23项符合资格标准，结果发现间充质干细胞与急性不良事件之间无相关性，表明MSCs治疗缺血性心脏病似乎是安全的。为进一步明确骨髓间充质干细胞的收益—风险状况，有必要进行精心设计、更大规模的随机对照试验。

此外，还有骨髓干细胞自噬问题、分化的细胞能否长期维持心肌细胞功能等问题。

4 小结与展望

尽管目前治疗急性心肌梗死的手段多样，但AMI的预后欠佳，病死率仍然居高不下，是心血管领域亟需攻克的一大难题，需要找到新的治疗方法来改变心肌梗死的预后。因此，国内外学者试图用干细胞移植来治疗心肌梗死，目前已有大量临床研究证实干细胞移植对于AMI的治疗有一定的疗效，但由于移植后分化率低、形成新的血栓、诱发心律失常、形成肿瘤，甚至有研究发现移植后并无改善心功能的作用等方面的问题，该治疗方法尚未应用于临床。但是，笔者仍相信干细胞在心肌梗死治疗领域的积极作用，并且预计该领域的迅速进展和生物技术的进步将解决这些问题，期待干细胞移植为心肌梗死的治疗开辟一条新“通路”。