环状RNA在肺纤维化中的研究进展

胡婷婷，曾林祥

(南昌大学第二附属医院呼吸与危重症医学科,南昌 330006)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种病因不明，累及肺实质的纤维化及炎性病变的组合，是临床上最常见和最致命的特发性间质性肺炎。其发病机制复杂，确诊后中位生存期仅为3～5年[1]。IPF病因不明，好发于老年人，其发病率呈上升趋势，在欧洲和北美，估计每年每10万人中有8～18例；亚洲和南美的发病率较低，每年(0.5～4.2)人/10万人[2]；我国尚缺乏肺纤维化的流行病学调查。IPF起源于反复的肺泡上皮细胞炎性损伤，激活产生多种细胞因子，从而诱导固有成纤维细胞增生，促进成纤维细胞和肌成纤维细胞的增殖及肌成纤维细胞分泌细胞外基质，导致肺瘢痕形成和不可逆转的功能丧失[3]。目前除肺移植外，IPF尚无确切有效的治疗方法。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是不含5′端帽子与3′端多聚A尾，由前体RNA首尾闭合形成的环状闭合结构的非编码RNA。circRNA闭合成环，对核酸外切酶有抗性，故较线性RNA更加稳定，能在细胞中不断累积。有些circRNA表达水平较高，部分circRNA的表达水平甚至超过线性异构体的10倍[4]。因此，大量积累的circRNA在各种疾病的发生发展中起着重要作用。circRNA广泛存在于各种生命体内，具有细胞信号传导、蛋白质翻译、基因调控等生物功能，其异常表达可影响缩窄性心包炎[5]、肿瘤[6]、生殖系统[7]等疾病的发生、发展。近年来由于基因测序及生物信息工程的发展，越来越多的circRNA被发现鉴定，且在哺乳动物中发现的circRNA更广泛和多样化[8]。本文就circRNA的生物学特性、功能以及其在PF中的研究进展进行综述。

1 circRNA的分类及生物学特性

1.1 circRNA的分类

根据circRNA的来源不同可将其分为内源性circRNA和外源性circRNA。内源性circRNA按组成成分的不同有3种:1)外显子circRNA，指仅由外显子组成的circRNA，主要存在于细胞质中，占circRNA的86.6%[9-10]；2)内含子circRNA，指仅由内含子组成的circRNA，主要存在于细胞核中[11]；3)外显子-内含子,其由内含子和外显子联合组成，主要存在于细胞核内[10,12]。外源性circRNA指存在体液，如血液、唾液、尿液等中的circRNA[10,13]。作为疾病的新兴生物标志物，circRNA对临床许多疾病包括肺纤维化的诊断及治疗有着潜在的应用价值。

1.2 circRNA的生物学特性

circRNA不包括典型的5′端帽子与3′端多聚A尾结构，由前体RNA首尾闭合形成环状结构，多数存在于细胞质中，少数在细胞核中表达。由于其特殊的结构，circRNA具有多种特定的生物学功能。

1.2.1 充当miRNA的分子海绵

circRNA是一类非编码RNA。部分circRNA上具有多个miRNA或相同miRNA的多个结合位点，可充当分子海绵，与靶基因竞争性结合miRNA，调节其信使RNA(mRNA)靶点来影响基因调控，进而抑制其生物学功能[10]。虽已发现数以万计的circRNA与其他RNA竞争miRNA结合位点，但只有几个circRNA被验证[14]。例如，Cdr1as在胰岛细胞中通过竞争结合miR-7促进胰岛细胞中胰岛素mRNA增加从而影响胰岛素的分泌[15]。ZHANG等[16]发现circRNA-vgll3通过竞争结合miR-326-5p抑制ITGA5的翻译对ADSCs的成骨分化具有调控作用，circRNA-vgl13调控后的ADSCs显著促进成骨分化的活性，从而促进了新骨的生成。另有研究[17]发现，circRNA_101237在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中明显上调，而circRNA_101237的高表达与淋巴转移、肿瘤体积大小、TNM分期呈正相关，通过进一步实验验证hsa_circ_101237通过miR-940海绵促进MAPK1的表达，从而影响肿瘤细胞的恶性进展。临床上可通过检验hsa_circ_101237的表达来预测NSCLC患者的不良预后[17]。而且，由于circRNA的丰度和稳定性，circRNA比非circRNA在海绵miRNA中更有效[4]，这对于充当miRNA海绵的RNA来说是一个明显的优势。通过对circRNA分子海绵作用的深入研究，circRNA有可能成为治疗各种疾病的靶点及疾病诊断与预后判断的标志物。

1.2.2 circRNA与转录因子结合参与转录调控

部分circRNA上具有miRNA结合位点，但大多数circRNA没有足够的miRNA结合位点来作为海绵发挥作用，而没有足够miRNA结合位点的circRNA可通过与转录因子等结合形成复合物后，参与调控mRNA的转录。有研究[18]发现，circMbl可以和MBL蛋白结合,干扰mRNA前体的剪接,降低MBL蛋白水平。DU等[19]发现circFoxo3通过与p21和Cdk2形成三元复合物后，减少了游离的Cdk2和p21，避免了cyclin E/Cdk2复合物的形成，同时也消除了p21对cyclin A/Cdk2复合体的抑制作用，使细胞周期进程被阻滞在G1期，不能过渡到S期，从而抑制了细胞周期进程。

1.2.3 部分circRNA编码肽链

长期以来，circRNA一直被认为作为功能性RNA直接参与各种生物过程。但近年发现部分circRNA具有翻译功能，且所产生的多肽在人类疾病的发生和发展中发挥着生物学作用。有研究[20]发现，circSHPRH具有开放阅读框架，可编码SHPRH-146aa，由含146个氨基酸的多肽组成，SHPRH-146aa是保护SHPRH免受泛素蛋白酶体降解的诱饵分子，从而增加SHPRH的水平。另有研究[21]发现circPP1R12A编码的PPP1R12A-73aa通过激活YAP1激活Hippo-YAP信号通路，从而提高癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

2 circRNA与肺纤维化

IPF是一种发病机制不明的源于肺泡上皮反复发生微小损伤后的异常修复,最终导致肺瘢痕形成和不可逆转的功能丧失。近年来，circRNA在肺部疾病中的作用成为研究热点，且与肺纤维化的发生发展有着密切的关系。

circRNA CDR1as(CIRS-7)是研究最多的circRNA之一。有研究[22]发现，在SiO2诱导的肺纤维化模型中，CIRS-7可以通过海绵作用于miR-7，而miR-7是一种重要的纤维化抑制因子，靶向转化生长因子-β(TGF-β)/smad信号通路，抑制内膜转化，从而促进TGF-β1的释放，在人支气管上皮细胞和A549细胞中发挥促纤维化分子的作用。LI等[23]发现circTADA2A通过miR-526b/Cav1抑制肺成纤维细胞的活化，通过miR-203/Cav2抑制肺成纤维细胞的增殖，从而抑制ECM的过度沉积减轻IPF。在astilbin处理组与博莱霉素(BLM)处理组肺纤维化小鼠模型中，circRNA 662和949可以作为miR 29b海绵靶向Gli2和STAT3发挥其功能。抑制STAT3表达可保护小鼠免受BLM诱导的肺纤维化[24]。Gli2是Hedgehog信号通路的一个组成部分，在astilbin作用下该通路在肺纤维化中起到调节作用[24]。另有研究[25]用微阵列鉴定IPF患者血浆中circRNA，共发现67个差异表达的circRNA，其中38个circRNA上调，29个circRNA下调，特别是circRNA_100906、circRNA_102100和circRNA_102348表达呈显著上调，而circRNA_101225、circRNA_104780和circRNA_101242表达呈明显下调。荧光素酶报告基因证实circRNA_100906和circRNA_102348分别与miR-324-5p和miR630有着直接的相互作用[25]，而miR-324-5p和miR630在特发性肺纤维化患者中表达下调。circHIPK3是肺组织中表达最丰富的circRNA之一。有研究[26]发现，在BLM诱导的小鼠肺纤维化模型中，HIPK3在成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(fibroblast-to-myofibroblast transition，FMT)来源的肌成纤维细胞中表达上调。在体内外实验中，circHIPK3沉默可以改善FMT，抑制成纤维细胞增殖。进一步研究[26]证实circHIPK3通过作为内源性miR-338-3p海绵调节FMT，并抑制miR-338-3p的活性，从而导致Sox4和COL1A1表达增加。另有研究[27]发现，circZC3H4RNA通过miR-212调节ZC3H4蛋白，从而激活巨噬细胞，激活的巨噬细胞进而促进成纤维细胞的增殖和迁移。ZHOU等[28]发现，在SiO2处理的巨噬细胞中circHECTD1表达减少，但在肺组织中积累。累积的circHECTD1可能与HECTD1蛋白竞争ZC3H12A来抑制ZC3H12A的泛素化，并影响巨噬细胞M1/M2的极化和激活，从而启动炎症级联反应。

3 circRNA作为竞争内源性RNA在肺纤维化中的作用

miRNA通过与mRNA结合来沉默基因，而circRNA通过竞争性结合miRNA来调节基因的表达。circRNA作为竞争性內源RNA，其有miRNA结合位点，可以结合特定的miRNA，调节miRNA和mRNA的结合[29]。circRNA/miRNA调控网络参与了许多肺纤维化的信号转导途径。例如，circRNA/miRNA/mRNA的竞争内源性RNA网络提示，circRNA保护的mRNA参与TGF-β1、缺氧诱导因子-1、Wnt、Janus激酶、Rho相关蛋白激酶、血管内皮生长因子等信号通路，其中circRNA_100906可能通过隔离miR-324-5p和miR-330-5p而触发SOCS1、ROCK1、SP1、NEMO样激酶、MMP1、含有2个溴域的溴结构域、ECM1、ITGBL1、磷酸肌醇-3-激酶调节亚基3和成纤维细胞生长因子受体2的上调[25]。LU等[24]在astilbin与BLM处理的肺纤维化小鼠模型中发现22个miRNA与circRNA-394、662、949和986的结合位点。进一步研究发现circRNA与RNA及其蛋白编码基因可以协作建立一个复杂的调控网络，这可能为探讨IPF的潜在分子机制提供了一条新的途径。

4 外泌体circRNA的潜在临床价值

外泌体是一种微型纳米级细胞外囊泡，其携带的核酸、蛋白质等内含物能够影响受体细胞的生理状态[30]。根据外泌体携带物质不同，对疾病产生的影响亦不同，外泌体可存在于生理体液中，如支气管肺泡灌洗液、血浆、恶性渗出液、尿液和痰液等[31-32]。目前在外泌体中已发现的RNA有mRNA、miRNA、circRNA。其中与circRNA紧密相连的外泌体是近年来的另一个研究热点。有研究[33]发现，在退行性鼻咽癌中外泌体转运的circRNA_0000253通过吸附miRNA1415p和下调sirt1被证实具有增加碘缺乏病的作用。另有研究[34]发现，circRNA_0044516通过下调miR-29a-3p的表达抑制了前列腺癌细胞的增殖和转移，提示cicRNA_0044516在前列腺癌中起致癌作用，可作为前列腺癌的潜在生物标志物。CHEN等[35]发现CIRC-0051443通过外泌体从正常细胞传播到肝癌细胞，通过促进细胞凋亡、阻滞细胞周期等途径抑制肝癌细胞的恶性生物学行为；同时在动物实验中发现外泌体CIRC-0051443通过上调裸鼠移植瘤BAK1的表达，降低移植瘤的重量和体积，提示外泌体CIRC-0051443可以作为肝癌的预测指标和潜在的治疗靶点。在肺纤维化中，目前针对外泌体的核酸研究主要集中于miRNA，而外泌体携带的circRNA对PF的影响需要进一步研究探索。

5 小结

综上，circRNA在PF中具有重要的调控性作用。首先，作为分子海绵，circRNA可作用于特定的miRNA及其相应的调控网络，进而影响肺纤维化的发生发展。其次，circRNA、miRNA以及其它靶蛋白之间存在相互调节的复杂网络，并可通过调控下游的信号通路如TGF-β1、缺氧诱导因子-1、成纤维细胞生长因子受体2等影响肺纤维化的发生发展。但是其海绵作用如何最大调控靶基因与miRNA之间的竞争以及基因的多元化仍是目前亟需解决的难题。尽管如此，circRNA作为肺纤维化诊断、治疗的靶点有着较大的潜在价值，需要深入探索。