一氧化氮信号通路与动脉粥样硬化

万 函，王秀芬，杨美雯，杨 蓓，吴 磊，洪芬芳，杨树龙

(1.南昌大学a.基础医学院生理教研室；b.医院护理部；c.基础医学院病原生物学实验中心，南昌 330006；2.南昌市卫生学校外科教研室，南昌 330008)

动脉粥样硬化(AS)是动脉硬化中常见且重要的一种血管病变，是一个复杂的病理过程[1]，同时也是导致冠状动脉疾病(CAD)、心力衰竭、中风等心脑血管疾病的根本原因。一氧化氮(NO)作为内皮衍生的舒张因子，是体内第一个被认为是信号传导介质的气体分子，不同条件下生成的NO对AS有抑制或促进作用，但其发病机制尚未完全阐明。本文就NO信号通路与AS的关系进行综述，为AS相关研究提供参考。

1 动脉粥样硬化的病理特点及其发病机制

AS是脂质在动脉中堆积、纤维化，形成内膜斑块后导致血管硬化、管腔狭窄和相应器官的缺血性改变[2]，是导致斑块发生发展和动脉血管进行性狭窄的炎性疾病。尽管对于斑块的形成、发展的病理过程尚无定论，但现有研究[1]显示吸烟史、高血压、冠心病、糖尿病、高血脂、饮酒等危险因素会加剧动脉粥样硬化的发生与发展。AS起始于动脉内膜的内皮细胞的激活，并引发单核细胞的募集和积累，其分化成巨噬细胞并吞噬脂质，变成泡沫细胞[3]。单核细胞通过清道夫受体(SR)依赖性摄取氧化低密度脂蛋白(oxLDL)，以及SR非依赖性摄取天然和修饰的oxLDL，转化成泡沫细胞[4]。oxLDL明显破坏了eNOS/iNOS的调节机制，通过HMGB1-TLR4-Caveolin-1途径下调了eNOS表达。另一方面，增加的oxLDL导致清道夫受体LOX-1的持续活化，并随后导致NF-κB活化，进而增加iNOS，从而导致内皮细胞氧化应激[5]。泡沫细胞产生高水平的促炎细胞因子，趋化因子和生长因子，引起平滑肌细胞增殖和迁移到内膜中，导致斑块生长和纤维化。AS斑块可以发展成稳定或易损斑块，其中大部分斑块是稳定的[6]。而破裂的斑块通常具有巨噬细胞大量渗透的纤维帽。这些巨噬细胞在斑块破裂的位点被激活，并能够通过吞噬作用或通过刺激金属蛋白酶的产生降解细胞外基质，这削弱了纤维帽并使斑块易于破裂。由于巨噬细胞和SMC浸润的内膜增生，血管管腔明显变窄，引起相应器官缺血性改变[6]。

现已有多种假说来解释AS的形成，包括动脉壁中胆固醇的沉积，病毒或细菌感染，损伤的应激反应，局部动脉炎症和自身免疫应答等。但AS发病机制复杂，其确切发病机制仍不清楚。目前关于AS发病机制的观点有：1)基因组中DNA甲基化对AS的发展起重要作用。DNA甲基转移酶在维持内皮细胞完整性，促进平滑肌细胞增殖和在动物模型中诱导动脉硬化形成中是关键[7]。2)线粒体功能受损和线粒体组分如线粒体DNA(mtDNA)损伤可能直接参与AS形成。有报道[8]显示至少4个线粒体基因组突变，即MT-RNR1基因中的A1555G，MT-TL1基因中的C3256T，MT-TL2中的G12315A和MT-CYB基因中的G15059A与人主动脉内膜中的脂肪纤维斑块相关。3)内皮细胞代谢紊乱引起其功能障碍，进而促进AS形成[3]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)是AS相关的细胞能量代谢的主要调节剂。有研究[9]表明在AS中miR-19-3p，miR-221-3p和miR-222-3p通过靶向PGC1α转录调制PGC-1，进而导致内皮细胞功能障碍。4)炎症和自身免疫性疾病也与AS形成有关。AS形成之初是由促炎Th1细胞和细胞因子免疫应答驱动。新观点包括由大多数无菌性炎症疾病共享的Th17/Th1轴。抗炎Th2细胞和细胞因子免疫应答与前两者一起引发，后者抑制它们的有害反应，最终导致完全的AS[10]。白细胞介素-33是IL-1细胞因子超家族的新成员，通过介导免疫反应的Th1到Th2转换参与抗AS反应。

2 一氧化氮在动脉粥样硬化中的作用

血管内皮NO生物利用度降低在AS进展中起关键作用。NO生物利用度的丧失，例如，底物(L-精氨酸)缺乏或eNOS的辅因子缺乏总导致有害的血管作用，如内皮功能受损和平滑肌细胞增殖增加，eNOS的底物(精氨酸)或辅助因子。各种不良反应低的药用植物及其生物活性化合物或次生代谢产物与预防心血管疾病有关，这可能与其通过增加NO的生物利用度，从而改善内皮功能障碍[11]。

NO由3种不同种型的一氧化氮合酶(NOS)合成，即eNOS，nNOS和iNOS。血管系统中的大多数NO由eNOS产生。内皮衍生的一氧化氮(eNO)是一种多功能信号分子，其作为有效的内源性血管扩张剂，能抑制血管损伤形成中的关键过程。eNO能减少ROS产生和减弱脂质过氧化，发挥抗AS作用[12]。此外，eNO还具有抑制血小板粘附和聚集，抑制粘附分子和趋化因子表达，减少炎症细胞浸润和平滑肌细胞迁移和增殖的作用。nNOS在AS中起到血管保护作用的第一个证据来自WILCOX等的工作，其显示斑块形成的进展和nNOS mRNA之间的相关性，这与动物实验显示的nNOS-KO小鼠加速新生内膜形成和收缩血管重塑的早期研究相一致[13]。在炎症条件下，血管细胞可以表达iNOS，其产生大量的NO导致血管功能障碍。实验结果表明脂联素的抗AS作用正是通过抑制iNOS而减弱氧化/氮化应激，减少超氧化物和ONOO-产生[14]。由此可见，生理情况下产生的NO具有抗AS的作用，而病理条件下生成的NO将引发或者加速AS。增强NO信号传导的遗传易感性与降低冠心病，外周动脉疾病和中风的风险有关。NO信号的药理刺激可能被证明可用于预防或治疗心血管疾病[15]。eNOS可作为预防和治疗AS的重要靶点[16]。

3 一氧化氮合成通路与动脉粥样硬化

3.1 eNOS相关的一氧化氮信号通路与AS

3.1.1 PI3K/AKT/eNOS/NO通路与AS

OxLDL结合LOX-1触发NADPH氧化酶的活化，产生活性氧(ROS)和脂质过氧化物自由基。此外，OxLDL诱发PI3K/AKT/eNOS/NO通路障碍导致NO生成减少，以及NO清除超氧化物阴离子、防止超氧化物阴离子形成其歧化产物和氢过氧化物的能力受损，最终导致内皮细胞损伤[17]。PI3K介导的Akt的活化涉及其在苏氨酸308和丝氨酸473上的磷酸化，活化的Akt通过激活eNOS产生NO[17]。磷酸肌酸(PCr)[17]、Myricitrin通过激活PI3K/AKT/eNOS/NO通路抑制ox-LDL诱导的人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡和减少AS斑块形成。高脂肪饮食诱导的AS大鼠模型和小鼠模型中的血管内皮功能障碍通过药物上调PI3K，AKT的mRNA和蛋白表达，增加eNOS磷酸化而缓解[18]。

有实验[19]对具有抗AS作用的乙酸甲酯的乙醇提取物(ERA)、颗粒蛋白、骨钙蛋白(OCN)处理的HUVEC中NOS-NO信号进行评估，结果表明ERA、颗粒蛋白、OCN处理的HUVEC中通过PI3k/Akt通路诱导eNOS磷酸化，NO水平显著上调。同时上述作用可被PI3K抑制剂和Akt抑制剂阻断[19]。ERA在动物实验中诱导分离的胸主动脉血管舒张被L-NAME(NOS抑制剂)消除[19]。

GONG等[20]选入40例颈动脉粥样硬化患者。3个月的时间内，每天给予患者奥美沙坦20 mg。研究结果显示奥美沙坦可以增加循环内皮祖细胞数量和eNOS和NO的血清水平。Spearman秩相关分析显示奥美沙坦对内皮祖细胞动员的促进作用与临床特征(如性别，年龄，血压等)之间无相关性(均P>0.05)。并得出奥美沙坦依赖于PI3K/AKT/eNOS/NO通路有效促进内皮祖细胞动员并提高其在颈动脉粥样硬化患者的功能的结论[20]。

鸢尾素(irisin)、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、Vaspin通过激活PI3K/AKT/eNOS/NO通路，增加NO产生，抑制HUVEC中高葡萄糖诱导的凋亡、氧化应激、NADPH氧化酶的生成和增加抗氧化酶表达，改善糖尿病相关的AS[21-22]。

二氢杨梅素(DMY)[23]降低了microRNA-21(miR-21)并增加了其靶基因二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶1(DDAH1)的表达，这种作用降低了不对称氨乙精胺(ADMA)的水平，并增加了内皮NO合酶(eNOS)的磷酸化和NO的产生培养的HUVEC，动脉粥样硬化病变的血管内皮和肝脏。DMY抑制Ox-LDL诱导的巨噬细胞M1型极化，其机制可能与激活JAK3/STAT5信号通路有关[23-24]。

3.1.2 Ca2+/CaMKK或CaMKII/AMPK/eNOS/NO通路与AS

eNOS是受钙池操作性钙内流(SOCE)调节的Ca2+依赖性酶，SOCE抑制剂诱导eNOS活性受损。YAMAGATA等[25]发现白细胞介素-1β(IL-1β)增强黏附分子的表达、减少NO生成并诱导动脉硬化。在培养的人内皮细胞中加入IL-1β，结果表明IL-1β降低Ca2+/CaMKII，PI3K，eNOS的表达，而增加细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的表达，提示IL-1β诱发的AS与Ca2+/CaMKII/eNOS/NO途径异常有关[25]。

β-胡萝卜素和桦木酸(BA)具有预防AS的作用，其通过Ca2+/CaMKK或CaMKII/AMPK/eNOS/NO途径介导[25-26]。实验研究[25-26]表明，添加β-胡萝卜素培养的人内皮细胞[25]、添加BA培养的EA.hy926 cells[26]中诱导的AMPK、eNOS磷酸化和NO生成水平增加。同时细胞内钙离子和钙离子/钙调蛋白依赖性激酶IIα(CaMKIIα)和钙离子/钙调素依赖蛋白激酶激酶β(CaMKKβ)的磷酸化水平提高。并且运用AMPK抑制剂化合物C、L型钙离子通道(LTCC)抑制剂、W7(CaM拮抗剂)、KN-93(CaMKII的选择性抑制剂)和STO 609(CaMKK的选择性抑制剂)处理降低eNOS磷酸化和NO产生水平。

3.1.3 Nrf2/HO-1/eNOS/NO通路与AS

核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)是一种氧化还原敏感的转录因子，通常存在于细胞质中，与Kelch样ECH相关蛋白(Keap)-1结合，Nrf2在确保NO的持续释放和保护免于凋亡中起重要作用。血红素加氧酶-1(HO-1)是一种抗氧化和抗炎症的诱导性酶，Nrf2被氧化应激激活后，进入细胞核，并与HO-1启动子中富含AU的元件结合以触发HO-1基因表达。有实验[27]证明寻常草枯草的水提物(APV)可诱导PI3K/Akt介导的Nrf2激活，抑制Keap1降解，进而诱导HO-1和eNOS的活化，增强NO的生成，从而抑制糖尿病相关的AS。

3.1.4 AMPK/AKT/eNOS/NO通路与AS

在人类内皮细胞和血管中通过激活AMPK增加eNOS磷酸化促进NO分泌；AMPK和AKT都是血管中eNOS活性的重要调节因子。有研究[27-28]表明在AS中oxLDL诱导的内皮氧化涉及AMPK/AKT/eNOS/NO通路的减弱。HUNG等[27]用oxLDL处理人脐静脉内皮细胞，用或不用槲皮素预处理。结果显示槲皮素对抗oxLDL引发AMPK活性降低，降低oxLDL活化的NOX2和NOX4。然而，AMPK减少了槲皮素抗氧化损伤的保护功能。同时，oxLDL抑制AKT/eNOS/NO，导致线粒体功能障碍，增强活性氧形成。OU等[28]用oxLDL处理人脐静脉内皮细胞，用或不用银杏叶提取物(GbE)预处理。Western印迹结果显示GbE抑制NADPH氧化酶亚基p47(phox)和Rac-1的膜易位，并减弱由oxLDL诱导的AMPK去磷酸化和随后激活的PKC引起的膜亚基gp91和p22(phox)的蛋白表达的增加。已经暴露于GbE的AMPK-α(1)特异性小干扰RNA转染细胞随后接触oxLDL显示PKC和p47(phox)水平升高。此外，暴露于oxLDL导致AMPK介导的Akt/eNO信号传导的减少[28]。

3.1.5 STAT3/DDAH/ADMA/eNOS/NO通路与AS

STAT3是调节细胞存活，炎症和血管生成的关键转录因子。不对称二甲基精氨酸(ADMA)，是由蛋白质中的精氨酸残基甲基化，并通过二甲基精氨酸二甲氨基水解酶(DDAH)代谢为瓜氨酸和二甲胺，是eNOS的内源性竞争性抑制剂[29]。JUNG等[29]研究表明，在Sprague-Dawley(SD)大鼠分离的主动脉模型中，vaspin通过STAT3介导影响DDAH Ⅱ启动子活性，降低ADMA和活化的DDAH Ⅱ基因表达的水平，最终以STAT3依赖性方式增加STAT3的磷酸化和eNOS活性，发挥抗AS作用。

3.1.6 OxLDL/精氨酸酶/eNOS-解偶联/NO通路与AS

高胆固醇血症通过影响eNOS的功能和活性降低血管NO生物利用度。oxLDL刺激血管壁中的NADPH氧化酶，介导eNOS辅因子四氢生物蝶呤(BH4)的氧化，导致eNOS发生解偶联。精氨酸酶(尿素循环中的一个关键酶)能直接与eNOS竞争共同底物L-精氨酸以及抑制eNOS的活性，影响NO的生成，导致内皮功能障碍。最近的研究都支持精氨酸酶(包括酶Ⅰ和酶Ⅱ)能引起eNOS解偶联，精氨酸酶的表达与活性在AS中上调。PANDEY等[30]研究发现人主动脉内皮细胞中和鼠主动脉内膜中OxLDL触发精氨酸酶2从线粒体转移到细胞质，并伴随精氨酸酶活性的上升，eNOS解偶联，内皮功能障碍和动脉粥样化形成。线粒体加工肽酶的抑制剂或凝集素样OxLDL受体-1敲除减弱OxLDL 介导的内皮特异性NO产生的减少和超氧化物生成的增加[30]。

3.2 iNOS相关的一氧化氮信号通路与AS

3.2.1 NF-κB-iNOS-NO通路与AS

NF-κB代表转录因子家族，包括在调节炎症反应中重要的p50和p65。NF-κBp50和p65转移到核，参与不同细胞过程(包括炎症，增殖，凋亡和细胞衰老)的多种基因的转录[31]。在人类AS病变中的巨噬细胞，平滑肌细胞和内皮细胞中已经发现活化的NF-κB，但是在健康的血管中没有发现。NF-κB调节iNOS基因：iNOS催化NO的产生，NO是在炎症和免疫应答中起作用的分子[32]。由病原体或细胞因子诱导的血管炎症反应伴随着过氧亚硝酸盐的产生，过氧亚硝酸盐是通过NO和超氧化物的反应形成的有效和血管毒性分子。P.g-LPS可能通激活NF-κB/iNOS/NO通路，诱导NO生成,导致内皮细胞氧化应激损伤,诱导其凋亡,直接破坏血管内皮,从而导致AS的发生发展[33]。NF-κB-iNOS-NO信号通路的激活加速AS的发展。

在大多数细胞类型中最常见的NF-κB形式是p65/p50异源二聚体，并且NF-κB信号受IκB激酶(IKK)复合体控制，IKK复合体由IKKa、IKKb、IKKc和下游底物IκBα(IκB的主要类型)组成。刺激后，活化的IKK磷酸化IkBa，导致IkBa降解，增强NF-κB核易位，以及随后的转录激活。rAd-APN-eGFP和PDTC一样可通过抑制核因子κB通路的激活来减轻动脉粥样硬化这种炎症反应[34]。

Ang Ⅱ[35]、H2O2[31]、TNF-α[32]活化NADH/NADPH氧化酶，诱导产生的ROS激活NF-kB信号通路。ROS已被假设为导致NF-kB活化的第二信使[35]。Ang Ⅱ诱导的人内皮细胞[35-36]、H2O2诱导的大鼠血管平滑肌细胞(RVSMC)[31]、TNF-α诱导的RVSMC[32]中ROS生成增加激活NF-kB信号通路。而使用药物预处理上述模型通过保护IkB-α抑制剂的降解和下调NF-κB亚基(p50和p65)的表达，抑制NF-κB转运进入细胞核，减弱iNOS生成NO，缓解AS的形成[31,35-36]。在糖尿病相关的AS中谷胱甘肽过氧化物酶-1(GPx1)是一个关键的抗氧化酶。GPx1基因敲除(GPx1 KO)小鼠分离的主动脉内皮细胞(PAECs)中IkBα降解延长，NF-κB通路的活化促进AS的发展。

在棕榈酸(PA)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型中，Honokiol通过抑制IKK/IκB/NF-κB信号通路中的IκB磷酸化和NF-κB活化，降低iNOS的表达和NO的生成，从而减轻PA引发的炎症反应以及修复内皮功能障碍[37]。

LPS与IFN-γ组合[38]和TNF-α诱导VSMC产生炎症反应，上述血管炎症促进AS等疾病的进展，其中涉及的通路除了IKK/IκBα/NF-κB/iNOS/NO通路，还包括IKK-IκBα-非依赖的-NF-κB-iNOS-NO通路。

PMC处理抑制VSMC中LPS与IFN-γ的作用，PMC显著抑制p65的易位和磷酸化，蛋白磷酸酶2A(PP2A)失活和ROS的形成，降低iNOS表达，而对IκBα降解、IκB激酶(IKK)没有影响[38]。PP2A选择性抑制剂冈田酸和用PP2A siRNA转染显着逆转PMC介导的iNOS表达、NF-κB启动子活性和p65磷酸化的抑制。LPS/IFN-γ刺激的VSMC的细胞提取物的免疫沉淀分析显示p65与PP2A共定位，PP2A诱导p65磷酸化。表明LPS/IFN-γ刺激通过激活ROS-PP2A-NF-κB p65-iNOS-NO通路促进AS[38]。

3.2.2 JAK2/STAT3-iNOS-NO与AS

在AS晚期，内皮和免疫细胞的STAT3激活可能加剧炎症[34]。炎症介质的过度或长期产生可导致AS。脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7巨噬细胞中iNOS、NO、环氧合酶-2(COX-2)等生成增加，药物处理通过抑制核信号转导和核易位转录(STAT)3活化，减少LPS介导的Janus的激酶(JAK)2和STAT3在Ser727和Tyr705位点的磷酸化，从而降低LPS介导的巨噬细胞炎症反应[39]。

3.2.3 MAPK(ERK1/2，JNK1/2和p38)-iNOS-NO与AS

TNF-α诱导人主动脉平滑肌细胞的炎症反应可以通过抑制p38 MAPK/ERK信号通路降低NO的产生而减轻[40]。

在LPS诱导的大鼠主动脉平滑肌(A7r5)细胞炎症反应模型中，用非细胞毒性浓度的TS和GA预处理(抗AS作用)通过下调iNOS显着抑制炎症性NO产生，iNOS/NO的抑制与MAPK(ERK1/2，JNK1/2和p38)磷酸化降低相关。YU等[39]研究发现RES(抗炎作用)降低LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中的NO，iNOS，同时抑制LPS诱导JNK/p38 MAPK信号通路的激活。综上可知炎症反应相关的MAPK信号通路促进AS的发展。

3.2.4 Nrf2/iNOS/NO与AS

有研究[35-36]表明，血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)处理的人内皮细胞(EA.hy926)和人主动脉平滑肌细胞(HASMC)中氧化应激增强。添加药物后通过增强Nrf2信号促进超氧化物歧化酶(SOD)的产生和诱导HO-1的表达，上述变化可以降低Ang Ⅱ引起的ROS生成，从而抑制ROS-NF-κB-iNOS-NO通路，缓解Ang Ⅱ引发的血管内皮功能障碍。Ang Ⅱ在巨噬细胞中激活PI3K后还可以增加巨噬细胞活性并增强免疫炎症反应,而这些过程均和AS的形成有关[41]。有效的Nrf2/抗氧化反应元件(ARE)激活抑制LPS诱导NF-kB核易位和DNA结合活性，并进一步阻止肝iNOS表达和NO生产。Nrf2敲除小鼠显示显着升高的iNOS表达。综上可知，Nrf2降低iNOS表达和NO的过度产生缓解AS的发展。

4 NO作用的信号通路与AS

NO通过刺激可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)生成环磷酸鸟苷(cGMP)调节血管平滑肌细胞的收缩程度。此外，NO还介导冠状动脉在缺氧状态下收缩程度的加强，该反应取决于sGC的含量但独立于cGMP的生成。SEGURA等[42]研究显示乙醇提取物Rumex acetosa L.(ERA)在分离的苯肾上腺素预收缩大鼠胸部主动脉的血管舒张作用被ODQ(sGC抑制剂)消除，从而得知NO介导的血管舒张由肌肉NO-sGC-cGMP信号通路进行调节。此外，ROS通过氧化NO受体sGC损伤NO的功能促进AS发展。GUCY1A3通过编码sGC的α1亚型，促进平滑肌细胞表型从收缩状态转换成合成状态，从而促进AS的形成。通过抑制sGC活性防止此种转换可能为AS疾病提供一个新的治疗目标[42]。

5 结语

eNOS、nNOS合成适量的NO发挥抗AS作用，而iNOS合成过多的NO促进AS发生和发展。在脂质浸润、氧化应激、炎症反应等病理条件下，eNOS、nNOS活性降低，iNOS活性增强，NO通过相关的信号通路促进AS形成。但目前NO信号通路与AS形成的作用机制尚未完全阐明，需要进一步的研究，有利于更好地认识和干预NO信号通路，为研究临床治疗AS的NO相关药物提供帮助。