非编码RNA 在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制△

罗长军，熊 思，张 敬，孙一帆，蒋 磊，谭 宁

［1.广西医科大学附属柳铁中心医院&柳铁临床医学院心内科，广西柳州 530021；2.广西医科大学附属柳铁中心医院&柳铁临床医学院超声科，广西柳州 530021；3.广西医科大学附属柳铁中心医院&柳铁临床医学院检验科，广西柳州 530021；4.广东省老年医学研究所广东省人民医院（广东省医学科学院），广州 510080；5.广东省心血管病研究所心内科广东省人民医院（广东省医学科学院），广州510080］

提要：非编码RNA 包括长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNAs），微小RNA（microRNAs，miRNAs）以及环状RNA（circular RNA，CircRNA）等，均已被证明会影响心肌缺血再灌注损伤，同时，这些非编码RNA 将有可能成为一个有吸引力的潜在治疗靶点。在此，本文回顾了非编码RNA 通过调控缺血预处理和缺血后处理影响缺血再灌注损伤的机制；同时探讨缺血再灌注损伤后非编码RNA 是如何介导线粒体功能从而影响心肌缺血再灌注损伤，及不同的非编码RNA 之间如何发生相互作用从而调控心肌缺血再灌注损伤。本文将对上述非编码RNA 在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制进行归纳，以求在未来的研究工作中更好地理解非编码RNA 在心血管疾病进展中的功能及机制。

缺血是指由于动脉血流受阻而导致组织供血不足，众所周知，缺血会导致组织损伤，但对缺血所导致的相关疾病的分子病理学进行深入研究后，人们发现缺血所导致的损伤并非如此单一，目前有充分证据支持，除缺血过程外，缺血后血流再灌注可以意外地促进和加重组织损伤及坏死，从而产生了“缺血/再灌注（缺血再灌注）损伤”的概念［1］，这种损伤在对氧高度依赖的心肌细胞尤为敏感。在缺血过程中，无氧代谢占据优势从而导致细胞内pH 值下降，而作为防止氢离子积聚的保护机制，Na+/H+交换泵会泵出额外的氢离子，而导致钠离子大量流入［2］。此外，缺血减少了三磷酸腺苷的储存，导致三磷酸腺苷酶失活，活性钙释放减少，同时内质网抑制钙离子的再吸收。这一级联事件导致细胞内钙超载的发生，从而导致细胞损伤或死亡。另一方面，缺血会引起线粒体通透性转换孔的暴露，随后会进一步导致线粒体膜电位崩溃，三磷酸腺苷合成受损。所有这些机制都会导致细胞及组织损伤，其程度取决于血流阻塞的程度和缺血时间的长短［3］，而缺血引起的生化系统紊乱可通过血液供应重建后氧气和其他血液成分的运输而加剧，进而引发一系列事件，使组织损伤加剧［4］。在这些机制发生的过程中，非编码RNA 发挥着极为关键的作用，其中非编码RNA 主要包括长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNAs），微小RNA（microRNAs，miRNAs）以及环状RNA（circular RNA，CircRNA），本文将对上述非编码RNA 在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制进行归纳，以求在未来的研究工作中更好地理解非编码RNA 在心血管疾病进展中的功能及机制。

1 微小RNA 在缺血再灌注损伤中的作用

miRNAs作为一种大小约为18～24个核苷酸的小调控转录物，调节与细胞生命功能、应激反应、增殖和凋亡等相关的关键功能［5］。而在缺血再灌注损伤中，miRNAs 的作用主要是通过介导与坏死、凋亡、炎症、纤维化和新生血管生成相关的关键信号通路［6］。由于缺血再灌注是因为组织供氧量的短暂减少引起的继发于急性动脉闭塞，随后迅速恢复血液流动，这会引发一连串的心肌细胞功能损伤和死亡。最初的缺血引起组织缺氧损伤，随后第二种损伤模式以再灌注后活性氧爆发为主要特征，同时伴随着活性氮和继发性炎症爆发以及线粒体功能失调［7-9］。在缺血之前，有几种潜在的治疗方式可通过靶向miRNA 减少心肌梗死的面积：缺血预处理（IPC）与远程缺血预处理（RIC）。缺血预处理是通过诱导激发自身保护机制而保护心脏的一种形式，特指在心肌长期缺血前进行亚损伤性缺血事件发作，此后，当真正发作缺血性事件时，心肌细胞损伤会因为早期“预处理”而显著减弱［10］。现有研究表明，在体外有两种主要miRNA 介导缺血预处理：miRNA-21 和miRNA-451［11］。小鼠和大鼠模型中，miRNAs 被证明具有明显的心肌保护及对抗缺血损伤作用，其中miRNA-451的心脏保护作用是通过减少氧化应激信号通路的激活，而miRNA-21 的保护作用被认为是通过调节PDCD4 而介导心肌细胞凋亡的减少从而保护心肌［12-13］。

远程缺血预处理是一种类似于缺血预处理的心肌保护，但是在远程缺血预处理中，亚损伤性缺血事件远离心脏本身，因此机制更为复杂［14］。目前研究表明，这种机制包括3 个步骤：在远程缺血点激活信号通路随后通过某种方式影响缺血后心脏［11］。目前还没有报道明确的miRNA可通过该种方式在缺血部位的表达从而形成远程调节。但是，已经有研究发现心肌组织中有miRNA 可通过血液循环的作用作为远程缺血预处的信号传感器发挥作用［15］。学者Li 等［16］研究发现，miRNA-144 在心肌缺血再灌注后的血浆和心脏中的表达明显改变，并发挥着重要保护作用，其机制可能就包含远程信号传感作用。还有许多其他miRNAs 在动物模型中被证明具有不同的心肌缺血后保护作用，例如，在永久性冠状动脉闭塞模型中，miRNA-21、miRNA-144 或miRNA-126 的改变会导致梗死面积增加，表明这些miRNAs 的保护作用［17-19］。

目前，已有报道证实miRNAs 可通过介导葡萄糖缺乏途径（OGD）从而影响心肌细胞功能，例如miRNA-132 在心肌细胞株H9c2 细胞的糖代谢，而调控miRNA-132 后可影响葡萄糖缺乏途径从而诱导这些心肌细胞的生命活性和凋亡激活。此外，miRNA-132 还能通过调节p21、p27 和p27 的表达从而阻止G0/G1 细胞凋亡及细胞周期蛋白D1表达，达到减轻葡萄糖缺乏途径诱导的心肌损伤的目的。此外，FOXO3A 已被证实为miRNA-132 的直接下游靶基因。综上所述，miRNA-132 可靶向抑制FOXO3A 从而保护心肌细胞在葡萄糖缺乏途径诱导下的损伤，而葡萄糖缺乏途径是缺血再灌注损伤的主要通路之一，miRNA-132 有望在心肌缺血再灌注损伤中发挥关键作用［20］。

2 长链非编码RNA 在缺血再灌注损伤中的作用

有证据表明，调节线粒体稳态可能是LncRNA 抑制细胞凋亡的一个重要机制［21］，目前已有报道LncRNAs 参与了调控心肌缺血再灌注损伤中线粒体分裂［22-23］。例如，CARL（心脏凋亡相关lncRNA）能靶向干扰miRNA-539 功能，而miRNA-539 自身可干扰prohibitin2 蛋白发挥关键功能，prohibitin 家族蛋白主要位于线粒体内膜，其作用是充当蛋白质和脂质调节线粒体代谢的支架［24］，过表达心肌组织中prohibitin2 能通过减少线粒体分裂和细胞凋亡从而有效抑制大鼠心肌缺血再灌注的梗死范围。因此，CARL可以通过干扰miRNA-539 而维持prohibitin2 功能从而减轻缺血再灌注后心肌细胞凋亡［22］。同时，该团队还报道了另一个线粒体动力学相关lncRNA-MDR，同样能在缺氧条件下调控心肌细胞线粒体的分裂，MDRL 通过发挥内源性海绵体作用吸附miRNA-361，从而抑制线粒体降解和细胞凋亡达到减轻缺氧复氧的心肌细胞损伤［23］。另有学者报道，最初发现于肿瘤中的LncRNA-HOTAIR（HOX 反义链上的基因间RNA），Li 等［25］发现抑制它的表达后可以加剧氧化应激诱导的H9c2 细胞凋亡，而过表达HOTAIR 后则可起到保护心肌细胞应激损伤的作用，HOTAIR 作用机制被认为与miRNA-125/MMP-2蛋白轴有关。另一方面，Meng 等［26］学者还证明了HOTAIR 可以通过激活细胞保护激酶AMPKα 从而抑制缺血再灌注诱导的H9c2 细胞凋亡。

在lncRNA 生物学的主要分子作用机制中，现有证据表明其ceRNA 作用（或miRNA 海绵）作为关键作用方式介导心肌缺血再灌注损伤，前文已提及相关的ceRNA-miR⁃NA-mRNA 相互作用参与调节缺血再灌注心肌细胞损伤。通常情况下，一个LncRNA 可拮抗一个或多个miRNAs，而miRNAs 则通过经典作用方式抑制下游靶基因的功能，从而促进mRNA 降解或阻碍翻译来抑制靶基因的表达达到调控细胞功能的目的［27］。因此，lncRNA 的增加有望增加其靶基因的蛋白质表达，除非在某些特殊情况下miRNA可增强基因表达。但有趣的是，我们注意到心肌细胞中的lncRNA 可能影响具有类似生物学效应的多个靶点（例如MALAT1 和Gas5）［28-29］，在这种情况下，我们推测最终的细胞功能状态变化会由其具体影响的不同路径而决定［30］。另一方面，一些LncRNAs 被证明与两个miRNAs 相互作用对细胞有冲突的影响（例如H19）。这仍需学者进一步研究其具体功能变化［31-32］。

目前已有一系列体内及体外实验明确了LncRNAs 在心肌细胞缺血再灌注过程中的功能，这些研究表明，LncRNAs 明确参与缺血再灌注损伤后的细胞坏死、凋亡、以及自噬，而这些LncRNAs 既可能发挥细胞保护作用也可能加重细胞损伤。值得一提的是LncRNA 的缺血再灌注研究绝大部分均是通过小动物模型进行验证，而LncRNA测序结果显示LncRNA 在物种中保守性较差，除了少数LncRNA，如MALAT1［33］。尽管如此，越来越多的研究表明LncRNA 的功能不仅仅是由一级核苷酸序列决定，其二级结构和时空表达模式也极为关键。因此，尽管序列保守性不一定高度一致，但一个LncRNA可能因为其二级结构和时空表达模式类似而在不同物种间发挥相似的功能［34］。

3 环状RNA 在缺血再灌注损伤中的作用

最近发现一种新颖的circRNA——circRNA-ACR：Au⁃tophagy Related RircRNA 具有心脏保护功能［35］，ACR 可通过与DNA 甲基转移酶家族成员Dnmt3B结合从而阻断Dnmt3B介导的Pink1 启动子甲基化。因此，ACR 可避免Pink1 启动子的降解，从而影响FAM65B 的Pink1 依赖性甲基化。Pink1 定位于细胞质，作为线粒体功能的相关激酶并维持线粒体的稳态［36-37］。更关键的是，Pink1 可通过磷酸化作用调控其下游靶基因［38］。在心肌缺血再灌注期间，自噬活性的改变可能会起到心脏保护作用，有研究证实ACRPink1-FAM65B 可通过级联反应而抑制自噬，并为治疗心肌缺血再灌注损伤的潜在分子机制提供了新的线索［39-40］。

研究还报道了一个线粒体分裂和凋亡相关的cir⁃cRNA-MFACR：Mitochondrial Fission and Apoptosis-Related CircRNA（也称mm9-circ-016597），miRNA-652-3p 有15 个疑似结合位点与其相关，当它被敲除的时候，海绵体吸附作用消失，miRNA-652-3p 的表达显著增加，从而能抑制由核基因MTP18编码的MTP18（线粒体蛋白，18 kDa）的功能［41］。而线粒体膜蛋白MTP18 在各种物种细胞的线粒体分裂中发挥关键作用［42-43］。MFACR 所参与的CircRNAmiRNA-mRNA 级联反应能有效减少线粒体分裂和凋亡，保护心肌细胞和心脏组织而减轻缺血再灌注损伤。还有一项研究报道表明，通过经典模型过氧化氢处理乳鼠心肌细胞或使小鼠心肌模拟缺血再灌注引起的损伤时，位于ncx1 基因转录本所转录的circRNA-circNCX1 在氧化应激期间表达量显著增加，而circNCX1 可通过海绵体吸附作用抑制miRNA-133a-3p 表达量，从而减弱促进细胞凋亡的核基因CDIP1对于心肌细胞缺血再灌注时的负性调控作用，因此，circNCX1-miRNA-133-3p-CDIP1 轴可能在氧化诱导下发挥重要作用从而调控心肌细胞凋亡［44］。此外，学者Wang 等［45］最近的一项研究表明，在心肌缺血再灌注损伤中，circRNA DLGAP4 可通过靶向miRNA-143 来调节BCL2 从而减轻心肌细胞凋亡。

本综述回顾了几种非编码RNA，主要是miRNA、Ln⁃cRNA 以及circRNA 在心肌缺血再灌注损伤时所发挥的功能及其作用机制，例如miRNA 主要通过影响缺血预处理或缺血后处理的关键通路；LncRNA 主要通过影响miRNA或直接通过高级空间结构作用于mRNA 影响心肌缺血再灌注损伤，且线粒体功能是其主要介导位点；而circRNA则主要通过miRNA 的海绵体吸附作用从而影响miRNA 下游靶基因发挥其调控作用。除了上述的功能及机制以外，心肌缺血再灌注相关的非编码RNA 仍有大量的未知需要我们阐明，而毫无疑问的是，非编码RNA 对于减轻心肌缺血再灌注损伤，具有重要的治疗靶点潜力，学者们对其进一步研究有望为该领域新药研发打下坚实基础。