肠道菌群在代谢相关脂肪性肝病中的作用

杨礼丹， 何 訸， 安振梅

四川大学华西医院 a.实验医学科， b.内分泌代谢科， 成都 610041

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)全球患病率高达25%，严重危害人类健康，并对社会造成巨大经济负担[1]。NAFLD患者肝脂肪变性向脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)的转变是引起肝硬化、肝细胞癌和肝移植的主要原因之一[2]。2020年初，国际专家小组发布共识声明[3]，将NAFLD更名为代谢相关脂肪性肝病(metabolism-related fatty liver disease, MAFLD)。这一更名有利于将其他慢性肝病患者(合并或不合并代谢异常)进行明确区分，同时也强调了代谢因素在慢性肝病诊断和治疗过程中的重要性。以下关于NAFLD的论述均替换为MAFLD。MAFLD是由多种代谢、环境、遗传和微生物机制介导的复杂疾病，与之相关的致病因素包括遗传(如PNPLA3基因多态性)、饮食(如果糖)、胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)和脂肪因子[4-5]。其他可能与MAFLD相关但还需要进一步研究的致病因素，目前关注较多的是内分泌干扰物和肠道菌群[6]。本文就肠道菌群在MAFLD中的作用及机制的研究进展作一综述。

1 肠肝轴

肠肝轴是指胃肠道和肝脏之间紧密的解剖学和功能关系。在包括NASH和肝硬化在内的多种临床相关疾病中，肠道通透性和微生物组组成及代谢的变化，均可能导致肠道菌群-肠屏障-肝脏这一轴线发生变化[7]。人类肠道菌群主要由拟杆菌门和厚壁菌门组成。变形杆菌门、疣微菌门、放线菌门、梭杆菌门和蓝细菌比例较少。从空肠到结肠，细菌的数量和多样性增加，并且主要细菌种类发生了变化[8]。在食道和近端小肠，链球菌属占优势，而在结肠中，厚壁菌门和拟杆菌门最为普遍[9]。肠道菌群受外源性(饮食习惯、食物纤维、不易消化的碳水化合物、生活方式、药物等)和内源性(细菌黏膜受体及其相互作用、肠道pH、免疫应答等)因素的影响[10]。细菌和病原体相关分子模式易位是肝病发生的重要病理生理过程[11]。大量研究表明，患有酒精性肝病或肝硬化的患者其肠道通透性增加，这可能是引起疾病进展的重要因素[12]。

2 MAFLD中肠道菌群种类的变化

MAFLD的危险因素(如饮食、肥胖和IR)均与肠道微生物有关[13-14]。将MAFLD小鼠的肠道菌群移植到无菌小鼠，发现肠道菌群在MAFLD的发生发展中起着重要作用[15]。Zhu等[16]通过16S核糖体RNA基因测序的方法比较了NASH、肥胖和健康儿童肠道菌群在门、科和属水平上的差异情况，结果显示健康受试者与肥胖患者(有或没有NASH)之间肠道菌群种属差异较大，而肥胖组和NASH组患者肠道菌群组成差异较小；与健康组相比，肥胖组和NASH组拟杆菌门比例增加，厚壁菌门比例减少；变形菌门的比例在健康组、肥胖组和NASH组中依次增加，而放线菌门的丰富度则依次减低；变形杆菌、肠杆菌科和埃希氏菌是在肥胖组和NASH组之间表现出显著差异的门、科和属类型，三者在NASH组中比例明显升高。Boursier等[17]对57例活检证实为MAFLD患者的粪便样本进行16S核糖体RNA基因测序，发现NASH与拟杆菌属增多有关，而瘤胃球菌增多则与晚期纤维化(≥F2纤维化期)有关。Tomas等[18]研究发现高脂饮食(high-fat diet, HFD)诱导的肥胖小鼠肠道厚壁菌门、变形菌门比例增高，而拟杆菌门比例降低，抗菌肽分泌减少，肠道通透性增加，回肠分泌黏液减少，这一系列变化引起肠道黏膜免疫防御功能减低。进一步研究发现这一改变主要通过HFD下调过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ表达实现，而加入PPARγ的特异性激动剂(罗格列酮)后，肠道黏膜防御功能得到改善。Turnbaugh等[19]通过将人类粪便移植到小鼠体内使小鼠的肠道菌群人源化，然后以高脂、高糖饮食(“西方饮食”)或植物性低脂饮食喂养小鼠，结果发现与饲喂植物性饮食的小鼠相比，饲喂高脂肪饮食的小鼠肠道菌群中拟杆菌门比例减低，而厚壁菌门比例增高。目前已有的研究均显示在超重或肥胖的人群或小鼠中，厚壁菌门与拟杆菌门比值增加，体质量减轻时伴随厚壁菌门与拟杆菌门比值降低。

3 肠道菌群代谢产物与MAFLD

3.1 短链脂肪酸(SCFA) 肠道细菌对膳食纤维的发酵是SCFA的主要来源，包括瘤胃球菌属、沙门氏菌属、鲍氏菌属、真杆菌属、无气溶胶菌属、粪球菌属、粪杆菌属等。SCFA通过门静脉吸收并输送至肝后，参与MAFLD的发生与发展。SCFA包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐等，丁酸盐是结肠细胞营养的主要来源。有研究[20]表明丁酸酯可参与调节肠屏障的完整性及增强屏障功能；丙酸酯补充剂可显著减轻体质量和减少肝内脂质含量，防止胰岛素敏感性进一步减低，并刺激人结肠细胞释放多肽-YY和胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide 1, GLP-1)。动物实验[21]表明，产丁酸盐的益生菌纠正了小鼠HFD引起的肠肝免疫失调和NASH，这一作用由SCFA所介导。SCFA主要通过激活G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor, GPR)41/43或通过抑制组蛋白脱乙酰基酶(histone deacetylase, HDAC)发挥其生物学功能。GPR41和GPR43的激活可以防止HFD诱发的肥胖、IR和血脂异常，部分与其促进GLP-1的产生并增加能量消耗有关[22]。补充丁酸酯(SCFA中HDAC的有效抑制剂)可以减轻HFD诱导的NASH，其潜在机制与改善肠道菌群失调和改善胃肠道屏障有关，进而抑制了肠道来源的内毒素向肝脏的输送[23]。

3.2 支链氨基酸(BCAA) BCAA由结肠中的细菌水解发酵蛋白产生，包括梭菌属、拟杆菌属、放线菌属、丙酸杆菌属和链球菌属等[24]。MAFLD患者血液和尿液中的BCAA(包括亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)水平升高[25]。BCAA水平的增加与BMI的增加相关[26]。BCAA可降低机体对病原体的敏感性，改善免疫功能，促进肠道有益细菌生长和增强肠道屏障功能[27]。血液循环中的BCAA水平与肝胰岛素敏感性呈负相关，研究[28]认为基线缬氨酸水平可预测肝脂肪堆积。进一步的动物实验[29]表明，补充BCAA可以减轻HFD引起的超重，但其对HFD小鼠造成明显的肝损害，这可能与脂解异常有关。另有一些研究[30-31]表明，BCAA干预可减轻动物模型中的NASH。这提示关于BCAA在代谢性疾病中的确切作用有待进一步研究。

3.3 胆汁酸 胆汁酸不是由肠道菌群直接产生，但其可被肠道菌群代谢(解偶联和去羟基化)，是肝脏与肠道之间关联的重要物质。胆汁酸的肠肝循环对脂质和葡萄糖代谢具有一定的生物学功能，并与NASH的发病机理和治疗有关。特定胆汁酸与NASH的组织学特征之间有一定关系，例如共轭胆酸和牛磺胆酸的含量与NAFLD活性评分(NAFLD activity score, NAS)呈负相关[32]。在应用丹宁片(调节胆汁酸代谢的中药)治疗MAFLD的早期临床试验[33]中，服药3个月后，患者的临床症状、血清ALT水平、血脂状况和超声下的脂肪肝严重程度均得到了明显改善。胆汁酸可通过表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的激活诱导肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)增殖而出现纤维化，而HSC可排出胆汁酸，进而抑制由胆汁酸诱导的细胞凋亡[34]。某些胆汁酸也可通过激活EGFR来调节人肠道单层上皮细胞的紧密连接结构和屏障功能，进而增加肠道通透性，促进肝纤维化的发生[35]。此外，胆汁酸是法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor, FXR)的配体，FXR介导的信号传导对肝脂质和碳水化合物的代谢具有有益作用，并且该信号传导途径还调节肝脏中主要的胆汁酸合成。亲脂性胆汁酸与FXR结合后，促进胰岛素敏感性，并减少肝糖异生和循环甘油三酯[36]。值得注意的是，HFD饲喂的MAFLD小鼠模型中，FXR通过调控肠道微生物群的肠道拮抗作用引起肝脂肪生成减少[37]。

3.4 内毒素和乙醇 IR是MAFLD发病的重要因素，且全身低炎症状态与IR有关。革兰阴性菌源性内毒素如脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)可刺激和加重肝坏死性炎症。当肝脏Kupffer细胞暴露于细菌LPS时，将通过激活Toll样受体、髓样分化因子88和核因子-κB的途径释放促炎细胞因子，其可激活HSC和纤维形成[38]。

乙醇是可导致肝脂肪变性和炎症发生并增加肝纤维化、肝细胞癌风险的物质。细菌发酵产生的内源性乙醇(主要是瘤胃球菌属)刺激MAFLD的氧化应激并加剧肝脏炎症，这在动物实验中得到了证实[39]。部分临床研究中内源性乙醇的作用并未得到一致结果，但其可能在NASH的发病机理中起着关键作用。

3.5 细菌胆碱代谢产物——三甲胺(TMA) 胆碱因其在预防MAFLD中的生理作用被列为必需营养素，胆碱缺乏饮食广泛应用于NASH动物模型[40]。机体主要从饮食中获得胆碱，胆碱可被肠道菌群(包括彭氏变形杆菌、大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌等)切断碳氮键代谢为TMA[41]。TMA通过门静脉进入肝脏，并被肝脏含黄素的单氧化酶氧化成三甲胺-N-氧化物(trimethylamine-N-oxide, TMAO)。一项临床研究[13]发现，血液循环中的TMAO水平与MAFLD的严重程度呈负相关。血清TMAO水平随BMI升高而升高，并与脂肪肝指数密切相关[42]。给HFD喂养的小鼠补充TMAO可以减轻糖耐量受损情况，增加胰岛素分泌，因此，TMAO对MAFLD的影响可能是一把双刃剑。此外，TMAO可以通过影响胆固醇的转运而降低胆汁酸的合成，从而减少极低密度脂蛋白的产生[43]。

4 肠道菌群联合多组学分析

鉴于全球范围内MAFLD的高发病率及其与肠道菌群的紧密联系，针对微生物组的研究为MAFLD发病机理及诊断和治疗提供了巨大的机遇和挑战。之前的大多数研究都采用16S rRNA测序技术，该技术只能提供微生物组成信息，因此必须使用高精度的宏基因组学测序技术在菌株水平上鉴定与MAFLD相关的微生物，该技术还可以提供肠道微生物组的功能信息。此外，随着高通量测序技术的发展，基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等也已经成为人们发现生命化学物质的基础和深入了解其分子机制的新方向。通过对多组学数据的整合分析，利用组学间的交叉互补，能更系统地在分子层面帮助研究肠道菌群与MAFLD之间的相互作用及机制。

多组学联合分析，不仅被用于研究MAFLD的分子机制，也已用于筛选非侵入性诊断标志物，预测疾病严重程度，甚至用于新药的评估等[27,44]。例如，基因集富集分析为基因组数据领域提供了关于酒精性和非酒精性肝病之间共享疾病通路的新知识[45]。同样，基因组数据的整合也强调了代谢综合征和MAFLD的共同遗传基础[46]。代谢物集富集分析是基因富集的代谢组学对应物,该分析可通过商业软件或免费软件运行，已被应用于证明MAFLD相关代谢途径的改变[47]。Del Chierico等[48]使用宏基因组学和代谢组学分析证明了颤螺旋菌属的减少伴随着2-丁酮水平上调，以及瘤胃球菌属的增加是MAFLD发病和MAFLD向NASH进展的标志。Lovric等[49]通过炎症相关的蛋白质组学、脂质组学和代谢组学联合分析，确定了一系列参数的独立作用，包括MAFLD男性患者心肌脂肪、心外膜脂肪、心包脂肪和肝脂肪中与炎症相关的血浆蛋白以及血浆脂质和代谢物的特征。Hoyles等[25]将粪便宏基因组学和肝转录组学、血浆和尿液代谢组学结合起来，揭示了非糖尿病肥胖女性中连接肠道微生物组和宿主表型与肝脂肪变性的分子网络，发现脂肪变性患者的微生物组基因丰富度较低，并且在以下几个方面表现出遗传潜力增加：膳食脂肪处理、内毒素生物合成(特别是变形杆菌)以及出现芳香族和BCAA的代谢紊乱等。研究者进一步通过细胞及动物实验证明了粪便微生物菌群移植和长期苯乙酸(芳香族氨基酸的微生物产物)治疗可以引起脂肪变性和触发BCAA代谢。此外，研究者通过整合宏基因组学、转录组学和代谢组学的信息建立并验证了一个预测肝脂肪变性的多元模型(AUC=87%)，与肠道微生物对脂肪变性的影响相一致，进一步提示微生物移植疗法的可行性。预计在不久的将来，MAFLD患者可以根据其“分子特征”进行诊断和治疗。

5 小结

MAFLD的发生、发展原理虽然已被广泛研究，但其机制尚未完全阐明。由肠道菌群失调、肠道屏障改变、肠道代谢产物紊乱和细菌易位引起的肠肝轴改变，可触发肝脏炎症和形成原纤维，最终导致MAFLD向NASH、肝硬化发展。此外，肠道菌群及其代谢产物也有望成为MAFLD的非侵入性诊断标志物，用于疾病早期诊断和对疾病严重程度的评估。无论是作为诊断标志物还是治疗靶点，肠道菌群及其代谢产物在MAFLD中的作用都值得更深一步研究，以期在精准医疗体制下更全面地了解影响人类代谢疾病的微生物因素，从而为肠道菌群靶向移植治疗和肝脏代谢稳态药物研发奠定基础。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：杨礼丹负责课题设计，资料分析，撰写论文；何訸参与修改论文；安振梅负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。