含两个手性中心的三唑类杀菌剂色谱分离研究进展

唐守英, 王 飞, 孟秀柔, 张钰萍

(贵州大学 精细化工研究开发中心，绿色农药与农业生物工程国家重点实验室，教育部绿色农药与生物工程重点实验室，贵阳 550025)

据统计，中国市场上的手性农药比例约占40%，并且比例还在不断上升[1]。目前，大部分手性农药仍以外消旋体形式生产和销售。手性农药的不同对映异构体之间往往存在活性或毒性的差异，其使用进入到环境后在吸收、分布、降解和代谢方面均有可能存在立体选择性，其中一种异构体可能存在高活性且低毒性。因此，使用高活性的异构体会对生态环境更友好。获得单一异构体是从对映体水平展开研究的基础。目前获得单一异构体主要有天然提取法和外消旋体分离两种方法[2]，其中天然提取法主要用于获得生物体内特有的单一异构体，如糖类、氨基酸、生物碱等；外消旋体的拆分主要用于化学合成的手性农药，而色谱技术则是对外消旋体进行快速拆分的理想方式。现如今，用于手性农药拆分的色谱技术主要有高效液相色谱 (HPLC)、毛细管电泳 (CE)、超临界流体色谱 (SFC)和气相色谱 (GC) 等。

三唑类杀菌剂具有杀菌谱广、活性高、杀菌速度快、持效期长及内吸传导性强等特点，在农业生产中应用广泛[3]。目前，在中国已商品化的三唑类杀菌剂有30余种，其中除三环唑和氟硅唑不含手性中心外，有18种含有1个手性中心，11种含有2个手性中心，以及1种 (种菌唑) 含有3个手性中心[4]，而有关种菌唑对映异构体的拆分研究还未见报道。2009年，张艳川等[5]对三唑类杀菌剂手性分离进行了综述，但由于时间较早，很多含两个手性中心的三唑类杀菌剂如苯醚甲环唑、联苯三唑醇、叶菌唑、苄氯三唑醇的手性分离情况尚未见报道。2019年，崔璇等[1]对农产品中残留的手性农药对映体的色谱分析研究进展进行了综述，梳理了农产品中手性农药残留分析方法。以上两篇报道均未对含有两个手性中心的三唑类杀菌剂对映异构体的色谱分离条件及分离结果进行系统的归类整理和总结。鉴于此，本文拟对国内外近年来研究较多的11种含有2个手性中心的三唑类杀菌剂对映异构体的色谱分离条件及结果进行综述，旨在为三唑类手性农药的进一步研发提供参考，为多手性中心的三唑类手性农药的分离分析和深入研究提供参考方法。

11种化合物的结构式见图式1，其异构体活性差异等信息见表1。

表1 11种含两个手性中心的三唑类杀菌剂基本信息Table 1 Basic information of 11 triazole fungicides with two chiral centers

手性固定相是手性农药进行手性识别和分离的关键，本文提到的色谱分离中所用到的手性柱的具体信息见表2。

表2 手性色谱柱基本信息Table 2 Basic information about chiral columns

1 高效液相色谱法

高效液相色谱法 (HPLC) 是三唑类手性农药对

映体拆分的主要方法，多使用紫外检测器 (UV) 和二极管阵列检测器 (DAD)。为了得到更灵敏的检测信号，高效液相色谱也常与质谱联用。高效液相色谱-串联质谱法 (HPLC-MS/MS) 具有灵敏度高、分辨率高、重现性好等优点，在农药残留检测中得到了广泛的应用。研究表明，在采用HPLC法拆分三唑类手性农药时，多糖手性固定相 (chiral stationary phase，CSP) 应用较为广泛，其中，Chiralcel OD和Chiralcel OJ两种手性柱应用最多[5]。

1.1 正相色谱法

采用HPLC-UV法对含有两个手性中心的三唑类杀菌剂进行拆分，大多是在正相液相色谱条件下进行，一般以正己烷为流动相主体，用乙醇和异丙醇调节流动相的极性。其特点是异构体在检测器中不被破坏，流动相中成分容易浓缩，非常适用于异构体的分析、制备。

采用正相色谱法拆分含有两个手性中心的三唑类杀菌剂可分为3种情况：第一，只含有一对对映体，拆分时只涉及到2个对映体的分离，如氟环唑和多效唑；第二，为4个对映异构体的外消旋体混合物，现有的正相色谱分离技术还不能在某种手性柱上完全拆分4个对映异构体，但能将其拆分成两对对映体，如三唑醇和联苯三唑醇；第三，由4个对映异构体组成，且都能成功拆分，如丙环唑、苯醚甲环唑和叶菌唑；目前，尚未见采用正相色谱法拆分苄氯三唑醇、环唑醇、糠菌唑和乙环唑的报道。

1.1.1 氟环唑和多效唑 1985年，巴斯夫公司创制了氟环唑，其分子中含有2个手性中心，存在4个对映异构体，但是商品化的氟环唑中只包含(2R, 3S)-(+)-氟环唑和 (2S,3R)-(−)-氟环唑两个对映体。2008—2010年，韩小茜等[16-17]研究发现，以正己烷和异丙醇为流动相在Chiralcel OD-H和Chiralcel OJ-H柱上拆分氟环唑能达到基线分离。2008年，常静等[18]在Chiralcel AD-H柱上基线分离了氟环唑，且最佳分离的流动相为V(正己烷) :V(无水乙醇) = 70 : 30。具体分离条件及分离度见表3。

商品化的多效唑由 (2R, 3R)-(+)-多效唑和 (2S,3S)-(−)-多效唑一对对映体组成。2008年，武彤等[19]利用Chiralcel OD-H和Chiralcel OJ-H手性柱拆分了多效唑。结果表明，Chiralcel OJ-H柱拆分效果比Chiralcel OD-H柱好，色谱分离条件及分离度见表3。

1.1.2 三唑醇和联苯三唑醇 2008年，曹巧[20]研究发现，三唑醇外消旋体在Chiralpak AS-H柱上能将其4个对映异构体分开，但是第二、三峰未能达到基线分离。以V(正己烷) :V(乙醇) = 95 :5为流动相，其保留时间分别为7.172、7.917、8.729和9.330 min，三唑醇的流出顺序依次为 (1R,2S)-(+)-、(1S, 2R)-(−)-、(1R, 2R)-(+)- 和 (1S, 2S)-(−)-三唑醇。随后，Dong等[8]在Chiralpak ASH柱上也以正己烷和乙醇为流动相，发现三唑醇的出峰顺序与曹巧的相同。为满足研究需要，研究人员将反式三唑醇对映体称为三唑醇-A，即(1R, 2S) 和 (1S, 2R)，顺式三唑醇对映体称为三唑醇-B，即 (1R, 2R) 和 (1S, 2S)。2012年，曹雅虹[21]先在非手性硅胶柱上把三唑醇拆分为三唑醇-A和三唑醇-B，再分别在手性柱上对三唑醇-A和三唑醇-B进行了拆分。以V(正己烷) :V(异丙醇) =100 : 3为流动相，三唑醇-A在Chiralcel OD-H柱上得到基线分离，且 (1R, 2S)-(+)-三唑醇先于 (1S,2R)-(−)-三唑醇出峰；三唑醇-B在Chiralcel OJH柱上取得很好的分离效果，(1R, 2R)-(+)-三唑醇先于 (1S, 2S)-(−)-三唑醇出峰。正相色谱法分离三唑醇的色谱条件及分离度见表3。

同年，武彤等[19]利用Chiralcel OD-H和Chiralcel OJ-H手性柱拆分了联苯三唑醇，结果只能实现联苯三唑醇两对对映体的基线拆分，且Chiralcel OJ-H柱拆分效果较好。色谱分离条件及分离度见表3。

1.1.3 丙环唑、苯醚甲环唑和叶菌唑 目前尚未确定丙环唑4个对映异构体的旋光性与绝对构型的关系。为了方便研究，程有普[10]根据丙环唑制剂及标准品中两对对映体的含量，将丙环唑顺式对映体定义为A体，包括 (2R, 4S) 和 (2S, 4R)；反式对映体定义为B体，包括 (2R, 4R) 和 (2S, 4S)；并将A体标记为 (+)-丙环唑A，(−)-丙环唑A；B体标记为 (+)-丙环唑B，(−)-丙环唑B。2003—2014年，Li等[22]、Bi等[23]、Zhou等[24]和程有普[10]分别报道了在正相色谱条件下拆分丙环唑，且丙环唑4个对映异构体在Chiralcel OD柱上拆分效果较好。其中，程有普[10]发现在Chiralcel ODH柱上，丙环唑4个对映异构体的出峰顺序为：(+)-丙环唑A、(−)-丙环唑B、(+)-丙环唑B、(−)-丙环唑A，在Chiralpak AD-H柱上依次为 (+)-丙环唑B、(−)-丙环唑B、(−)-丙环唑A、(+)-丙环唑A，且在2种手性柱上丙环唑4个对映异构体均实现了基线分离。丙环唑在Chiralcel OD、Chiralcel OD-H和Chiralcel AD-H柱上典型的分离条件及分离度见表3。

表3 正相色谱法分离检测三唑类手性农药Table 3 Separation and detection of chiral triazole pesticides by normal phase chromatography

此外，Zhou等[24]、李晶[11]和Dong等[25]研究表明，正相条件下，苯醚甲环唑在Chiralcel OD柱上没能拆分，而在Chiralcel OJ-H柱上以正己烷和乙醇为流动相的拆分效果比其在Chiralcel OD柱上好，洗脱顺序为 (2R, 4R)、(2R, 4S)、(2S,4R)、(2S, 4S)-苯醚甲环唑[25]。贺敏[4]利用超高效液相色谱-串联质谱法 (UPLC-MS/MS) 以正己烷和甲醇梯度洗脱，在Chiralpak IB-3柱上实现了苯醚甲环唑4个对映异构体的基线分离；出峰顺序分别为 (2R, 4R)、(2S, 4S)、(2S, 4R)、(2R, 4S)-苯醚甲环唑，保留时间分别为5.96、6.38、6.82、7.37 min。分离度见表3。2018年，He等[12]采用Enantiopak OD和Enantiopak AD柱成功拆分了叶菌唑4个对映异构体，分离度均大于1.5。

1.2 反相色谱法

反相色谱系统的流动相以水为主体，以甲醇、乙腈等调节流动相的极性。根据报道，反向色谱法拆分含两个手性中心的三唑类杀菌剂多是用质谱做检测器，通常使用HPLC-MS/MS或UPLCMS/MS技术分析。为了提高质谱信号，流动相中经常加入少量甲酸、乙酸、醋酸铵等调节pH值。

采用反相色谱法拆分含两个手性中心的三唑类杀菌剂可分为4种情况﹕第一，只含有一对对映体，如氟环唑和多效唑；第二，对于含有4个对映异构体的外消旋体混合物，反相色谱分离技术能将其拆分成两对对映体，如苄氯三唑醇；第三，能够实现4个对映异构体的基线分离，如三唑醇、联苯三唑醇、丙环唑、环唑醇和糠菌唑；第四，没有完全实现4个对映异构体的基线分离，如苯醚甲环唑。上述9种杀菌剂的色谱分离条件及分离度见表4。特别的是，在反相系统下能成功拆分正相色谱法无法完成4个对映异构体拆分的3种杀菌剂 (三唑醇、联苯三唑醇和环唑醇)，但是尚未见采用反相色谱法成功拆分乙环唑和叶菌唑的报道。

1.2.1 氟环唑和多效唑 在反相色谱条件下，氟环唑和多效唑能在多种固定相中实现基线分离。如韩小茜等[16]、Zhang等[26]、李远播[27]、梁宏武[28]、Chen等[29]、Kaziem等[6]和Qi等[30]采用CDMPC固定相成功拆分了氟环唑和多效唑，结果均为(2S, 3R)-(−)-氟环唑先于 (2R, 3S)-(+)-氟环唑出峰；(2R, 3R)-(+)-多效唑先于 (2S, 3S)-(−)-多效唑出峰。此外，Zhang[26]还在CCMPC固定相中成功拆分了氟环唑和多效唑。Zhao等[31-32]和Matías等[33]在ACMPC固定相中也成功拆分了氟环唑和多效唑。采用反相色谱法拆分氟环唑和多效唑的分离条件及分离度见表4。

1.2.2 苄氯三唑醇 目前，采用反相色谱法尚未实现对苄氯三唑醇4个对映异构体的完全拆分，但是能将其拆分成两对对映体。2012年，Zhang等[26]采用反相HPLC-MS/MS法研究发现，苄氯三唑醇4个对映异构体在Lux cellulose-1和Lux amylose-2柱上均只能拆分成两对对映体，分离条件及分离度见表4。

1.2.3 三唑醇、联苯三唑醇、丙环唑、环唑醇和糠菌唑 环唑醇、丙环唑、三唑醇、联苯三唑醇和糠菌唑在反相色谱条件下均能够实现4个对映异构体的基线拆分。2006年，Buerge等[34]在由纯多孔硅胶微球制成的Zorbax Rx-C18柱 [25 cm ×4.6 mm (i.d)] 上分离了环唑醇，以V(水) :V(乙腈) :V(甲醇) = 55 : 35 : 10为流动相，在11.25～12.00 min处收集提取A组分，在12.75～13.75 min收集提取B组分。2012年，Zhang等[26]在4种手性柱 (Lux cellulose-1、Lux cellulose-2、Lux cellulose-3、Lux amylose-2) 上研究了环唑醇、丙环唑、糠菌唑、三唑醇和联苯三唑醇的拆分。结果发现，以上5个化合物的4个对映异构体均能实现基线分离，分离条件及分离度见表4。之后，李远播[27]利用超高效液相色谱-串联四极杆液质联用仪 (Acquity UPLC-TQD) 在ChiralpakOD-RH柱上以V(乙腈) :V(2 mmol/L乙酸铵水溶液) = 55 :45为流动相拆分了三唑醇。结果表明，三唑醇4个对映异构体的出峰顺序依次为 (1S, 2R)-(−)-三唑醇、(1R, 2S)-(+)-三唑醇、(1S, 2S)-(−)-三唑醇、(1R, 2R)-(+)-三唑醇。2020年，Li等[9]采用UPLCMS/MS技术，在Chiralcel OD-3R手性柱上实现了联苯三唑醇手性异构体的基线分离。

表4 反相色谱法分离检测三唑类手性农药Table 4 Separation and detection of triazole chiral pesticides by reversedphase chromatography

1.2.4 苯醚甲环唑 采用反向色谱系统尚未实现对苯醚甲环唑4个对映异构体的基线分离。Zhang等[26]采用Lux cellulose-3手性柱对苯醚甲环唑进行了分离，其分离度为1.48、1.18和1.25。Matías等[33]在Chiralpak IG-3柱上拆分苯醚甲环唑，发现第一和第二峰没有基线分离，但第二、三、四峰均获得了基线分离，分离度为 <1.00、2.95和3.95。

2 超临界流体色谱法

超临界流体色谱 (supercritical fluid chromatography，SFC) 作为一种绿色的色谱分离技术，也被用于含两个手性中心的三唑类杀菌剂的分离。超临界二氧化碳流体的黏度接近于气体，密度接近于液体，溶质的传质阻力小，传质速度快，具有高效、快速的特点，但超临界CO2极性较弱，在色谱分离中需加入一定量的极性溶剂以提高洗脱强度和选择性。

超临界流体色谱法拆分含两个手性中心的三唑类杀菌剂可分为4种情况：

第一，商品药中只含有一对对映体，如氟环唑和多效唑。研究发现[37-39]，氟环唑和多效唑在Chiralcel OD-H柱上能实现最优分离。

第二，商品药为4个对映异构体的外消旋体混合物，但只能将其拆分成两对对映体，如三唑醇；在SFC条件下，三唑醇在Chiralpak AD柱上拆分效果最好[40]。

第三，商品药中含有4个对映异构体，且都能实现成功拆分，如丙环唑、联苯三唑醇、苄氯三唑醇、叶菌唑和糠菌唑。Toribio等[41]采用Chiralpak AD柱实现了丙环唑的分离。此外，缪叶隆等[38]、郑夏琼[39]分别用Chiralcel OD-H、Chiralpak IB和Sino-Chiral OJ柱实现了联苯三唑醇、苄氯三唑醇、叶菌唑和糠菌唑的拆分。

第四，化合物的4个对映异构体没有实现完全基线分离，如苯醚甲环唑、环唑醇和乙环唑。但苯醚甲环唑和乙环唑在Chiralcel OD-H柱上实现了最优分离。Toribio等[41]采用Chiralpak AD柱实现了环唑醇的部分分离；此外，环唑醇4个对映异构体在Enantiopak OD手性柱上通过V(乙腈) :V(水) =60 : 40的洗脱顺序为 (2R, 3R)-(+)-、(2R,3S)-(+)-、(2S, 3S)-(−)-、(2S, 3R)-(−)-环唑醇[35]。超临界流体色谱法拆分11种农药的色谱分离条件及分离度见表5。

表5 超临界流体色谱法分离检测含两个手性中心的三唑类杀菌剂Table 5 Separation and detection of ten triazole fungicides with two chiral centers by supercritical fluid chromatography

3 毛细管电泳法

毛细管电泳 (capillary electrophoresis，CE) 以其高分辨能力在各个分析领域被认为是一种高效的分离技术[42]。近年来，在医药和农业科学领域，毛细管电泳在微尺度和快速分析方面得到了广泛的应用[43]。在三唑类手性农药的分离中，毛细管电泳也显示了良好的拆分能力。

目前，已有采用毛细管电泳成功拆分三唑醇、氟环唑、环唑醇、丙环唑、多效唑、联苯三唑醇、三唑醇及苯醚甲环唑的报道。如Wu等[44]以磺酸化-β-环糊精 (S-β-CD) 作为手性选择剂成功拆分了三唑醇种对映异构体；之后，Otsuka等[45]以衍生化-γ-环糊精 (HP-γ-CD) 为手性选择剂，在胶束电动毛细管电泳技术 (CD-MEKC) 模式及pH7.0的条件下，也实现了三唑醇4种对映异构体的完全拆分。不久，Wu等[44]课题组进一步成功拆分了多效唑、三唑醇、联苯三唑醇、丙环唑、苯醚甲环唑及环唑醇。此外，Buerge等[34]曾使用自制的HP-β-CD分别成功拆分了氟环唑和环唑醇，在20 min内，对映体均能得到很好的拆分。Ibrahim等[46]和Garrison等[47]采用环糊精修饰的CD-MEKC，以HP-γ-CD为手性选择剂，在pH值分别为7和3的情况下，实现了丙环唑4种异构体的基线分离。相对来说，采用毛细管电泳拆分三唑类手性农药的研究较少，还有待进一步研究。

4 气相色谱法

气相色谱 (gas chromatography，GC) 是一种高效的分离技术，具有足够的灵敏度，并且很容易与质谱结合，这些特性使GC成为分析农药残留和污染物的合适工具。然而，有限的适用于气相色谱分离的固定相数量限制了GC的使用。2010年，Kenneke等[48]利用GC-MS结合瑞士BGB 172 (20%三-丁基二甲基硅烷基-β-环糊精) 手性毛细管气相色谱柱实现了三唑醇4个对映异构体的基线分离。2011年，Garrison等[47]报道了用BGB 172柱能够实现丙环唑一对对映体的基线分离，但另一对对映体分离程度仅达到13%。

5 合相色谱法

超高效合相色谱 (ultra performance convergence chromatography, UPC2) 利用超临界状态下液化气体的密度差异进行色谱分离，兼具正相色谱的优势及选择性和反相色谱的易用性及简便的方法开发功能。2014年，程有普[10]采用UPC2-MS/MS和Chiralpak IA-3柱，以含1.0%甲酸的甲醇为流动相，在流速2.2 mL/min、30 ℃条件下丙环唑4个对映异构体的分离度分别为1.77、1.61和2.80，且最后出峰时间约5 min，出峰顺序为 (+)-丙环唑B、(−)-丙环唑B、(−)-丙环唑A和(+)-丙环唑A。

6 总结及展望

三唑类杀菌剂具有长久的应用前景和研究价值。迄今为止，含一个手性中心的三唑类杀菌剂的分离及对映体毒性、环境行为差异性已有广泛的研究，但是含两个手性中心的三唑类杀菌剂因具有4个对映异构体，在分离检测时难度相对更大，有的农药分离效果并不理想，纯对映体的获得和检测方法均受到一定程度的限制，导致其对映体毒性、环境行为差异性研究还不是很充分，所以还有待进一步深入研究。从本文综述内容可知，11种含两个手性中心的三唑类杀菌剂中除了乙环唑没能实现4个对映异构体的基线分离外，其他10种已均有使其异构体实现基线分离的方法。从分析方法看，目前仍是以高效液相色谱法为主，其中反相色谱法结合质谱检测的HPLC-MS/MS技术因其对复杂样品的高分离能力、高选择性、高灵敏度等优点，在手性农药对映异构体的分离检测方面表现出较好的应用前景。手性农药中往往存在活性体和非活性体，并且其毒性及环境行为存在差异。现阶段，含两个手性中心的三唑类杀菌剂在对映体水平上开展的活性、非靶标毒性、毒性机制、生物降解、生物富集、对映异构体稳定性等研究还相当缺乏。三唑类杀菌剂手性分离与检测技术的开发，将为上述对映体水平上的相关研究提供良好的技术基础，对未来更好地开发一类高效、超低用量、高选择性、对人类健康安全的手性三唑类杀菌剂具有重要的科学意义。