斜纹夜蛾SlGSTO2 对拟除虫菊酯类和有机磷类杀虫剂体外代谢及其抗氧化活性

何承帅, 谢兰芬, 徐 莉, 段雪莲, 任青青,郭佳佳, 吴艳兵, 李冬植

(河南科技学院 资源与环境学院, 河南 新乡453003)

斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius) 是一种世界范围内分布的暴食性农业害虫，具有繁殖能力强、寄主植物种类多、世代交替、易暴发成灾等特点，对农业生产和城市绿化造成严重的危害。根据斜纹夜蛾的发生特点，目前对其防治仍以施用化学药剂为主，其中，拟除虫菊酯类 (以下简称菊酯类) 和有机磷类杀虫剂因广谱高效，且价格低廉，被广泛用于斜纹夜蛾等鳞翅目害虫的防治，但由于存在频繁使用，加之施用时间不科学、施用剂量不准确、操作不规范等问题，导致斜纹夜蛾对菊酯类和有机磷类杀虫剂的抗性问题突出[1-3]，致使药剂防效下降甚至完全失效，造成严重的经济损失。对斜纹夜蛾的抗性机制进行研究是合理制定田间综合防治措施的基础，对于斜纹夜蛾抗性治理具有重要意义。

谷胱甘肽S-转移酶 (glutathioneS-transferases，GSTs) 是生物体中重要的解毒酶系，其参与的代谢作用增强是害虫产生抗性的重要原因[4-5]。昆虫中的GSTs 包含微粒体GSTs (microsomal GSTs) 和胞质GSTs (cytosolic GSTs) ，胞质GSTs 可分为Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta 和Zeta 6个主要家族以及1 个未分类家族(unclassified)[6-8]。GSTs 主要通过催化还原型谷胱甘肽 (reduced glutathione，GSH) 和杀虫剂的轭合参与对杀虫剂的解毒。例如，东方果实蝇Bactrocera dorsalis中的BdGSTE2和BdGSTE4基因在抗马拉硫磷种群中显著过量表达，研究发现其重组蛋白对马拉硫磷有催化轭合作用，用RNAi 技术将这两个基因分别沉默能够增加东方果实蝇对马拉硫磷的敏感性，表明这两个基因参与了东方果实蝇对马拉硫磷的抗性[9]。Meng 等[10]报道了东方果实蝇中BdGSTd1和BdGSTd10基因也具有类似的功能活性，可介导其对马拉硫磷抗性的产生。同时GSTs还具有与杀虫剂直接结合进行区域化隔离的能力以及抗氧化活性[11-12]。Kostaropoulos 等[13]利用荧光结合试验和色谱分析法研究黄粉虫Tenebrio molitor对氯氰菊酯的抗性机制时发现，氯氰菊酯可与黄粉虫的GSTs 活性中心结合。Wilding 等[14]发现冈比亚按蚊Anopheles gambiae和阿拉伯按蚊A. arabiensis抗性种群中过量表达的GSTE4基因对菊酯类药剂没有直接代谢作用，但可以通过与药剂的结合起隔离贮存的作用。

斜纹夜蛾中已鉴定出20 个Epsilon、5 个Delta、7 个Sigma、2 个Zeta、3 个Omega、1 个Theta 和4 个Unclassfied 家族的GSTs 基因[15]，是已知GSTs 数量较多的害虫[16-17]，其中对Epsilon家族基因在杀虫剂抗性中的研究较多。如SlGSTE1 重组蛋白具有与多种杀虫剂结合的活性和抗氧化活性[18]，RNAi 介导的该基因沉默可以显著增加斜纹夜蛾对氰戊菊酯的敏感性[19]。SlGSTE2基因可被甲萘威、DDT、溴氰菊酯、虫酰肼和Bt 诱导表达，异源表达发现，DDT 和溴氰菊酯可以显著抑制SlGSTE2 重组蛋白对模式底物1-氯-2,4-二硝基苯 (1-chloro-2,4-dinitrobenzene, CDNB)的酶活性[20]。SlGSTE7 和SlGSTE20 重组蛋白对底物CDNB 的活性可被二嗪磷、虫威、氯菊酯和虫螨腈显著抑制，尤其是二嗪磷[21]。也有文献报道，GSTs Omega 家族基因在昆虫的解毒代谢中发挥重要作用，如将抗茚虫威的小菜蛾Plutella xylostella的GSTO4基因沉默，可以显著增加茚虫威对其的毒力[22]。此外，GSTs Omega 家族基因在医学上还有减少氧化损伤和阻止DNA 损伤的重要作用[23]，而目前尚未见对斜纹夜蛾中该家族基因的研究报道。

前期通过转录组测序 (RNA-Seq) 和实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 分析发现，SlGSTO2基因在抗菊酯类斜纹夜蛾种群的3 龄幼虫中显著上调表达[19]，为了探究该基因在菊酯类和有机磷类杀虫剂抗性中的作用，本文通过原核表达测定了其对这两类杀虫剂的代谢活性及其抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

本研究以室内多代饲养的相对敏感种群即广西种群 (GX) 斜纹夜蛾作为供试昆虫，试虫采集信息和饲养条件参照Xu 等[19]报道。

1.2 药剂、试剂与仪器

93.4% 氰戊菊酯 (fenvalerate) 原药， 购自江苏常州常隆化工有限公司；95.0% 高效氯氰菊酯 (betacypermethrin) 原药 、98.4% 三氟氯氰菊酯(cyhalothrin) 原药 、91.0% 辛硫磷 (phoxim) 原药和95.0% 毒死蜱 (chlorpyrifos) 原药，均购自北京华戎凯威植保生物科技有限公司。CDNB、GSH、99% 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、99.5% 甘氨酸(glycine)、丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(mcrylamides/bis-acrylamide, 质量比29 : 1，生化级) 和过氧化氢异丙苯 (cumene hydroperoxide, CHP) ，均购自百灵威科技(北京)有限公司；RNA 提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ，均购自宝生物工程 (大连) 有限公司；FastQuant RT Kit、pLB 零背景快速克隆试剂盒、大肠杆菌Escherichia coliBL21 (DE3) 感受态细胞、异丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside, IPTG) 、卡那霉素 (kanamycin，Kan)和Bradford 蛋白质定量试剂盒，均购自天根生化科技 (北京) 有限公司；HisPurTMNi-NTA Purification Kit 蛋白纯化试剂盒、ZebaTMSpin Desalting Columns 旋转脱盐柱与乙腈 (HPLC 级) ，均购自赛默飞世尔科技 (中国) 有限公司；超声波细胞破碎仪VCX2500 购自美国Sonics & Materials公司；Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS 超高效液相色谱 (Ultra-Performance Liquid Chromatography,UPLC) 购自美国Waters 公司。

1.3 表达载体的构建

用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 提取斜纹夜蛾3 龄幼虫的总RNA，参照Fast-Quant RT Kit 的说明书对总RNA 进行反转录和cDNA 第一链合成。以cDNA 为模板，以分别在5′ 端引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的SlGSTO2-F1 和SlGSTO2-R1 为引物对 (引物设计如表1 所示) ，扩增SlGSTO2基因的cDNA 全长，并连接到pLB 载体中，用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ将其和表达载体pET-26b(+)进行双酶切，将酶切后的产物进行连接，从而构建重组质粒pET-26b(+)/SlGSTO2，其结构如图1 所示。

表1 SlGSTO2 基因cDNA 全长扩增的引物对Table 1 Primer pairs used in cDNA full length amplification of SlGSTO2 gene

1.4 重组蛋白的分离纯化和电泳

采用热击法将重组质粒转化到大肠杆菌E.coliBL21 (DE3) 中。将转化成功的大肠杆菌在LB 液体培养基中振荡培养 (37 °C，160 r/min) 至OD600= 0.6，加入IPTG 使其终浓度为1.0 mmol/L ，诱导重组蛋白SlGSTO2 在大肠杆菌中表达。将其在37 °C、160 r/min 下振荡诱导培养3 h，随后在4 °C、10 000g下离心10 min，弃去上清液，加入适量磷酸缓冲液 (PBS，20 mmol/L，pH 7.0) 以重悬菌体，用超声波细胞破碎仪超声处理10 min (工作10 s，暂停5 s) 使细胞裂解，经20 000g离心30 min，收集上清液即为重组蛋白SlGSTO2 粗提液。采用HisPurTMNi-NTA Purification Kit 进一步纯化重组蛋白，用ZebaTMSpin Desalting Columns进行去盐。以上所有步骤均在4 °C 或冰上进行。

采用Bradford 蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度，用PBS 将上述纯化重组蛋白稀释至1 mg/mL。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 (SDSPAGE，12.5%) 电泳鉴定重组蛋白是否成功表达。

1.5 SlGSTO2 重组蛋白离体代谢活性测定

采用超高效液相色谱测定SlGSTO2 对菊酯类和有机磷类杀虫剂的体外代谢活性。参照Riveron等[7]的方法并稍作修改。将180 μL 纯化的重组蛋白 (1 mg/mL) 加入到250 μL 的PBS (0.1 mol/L，pH 6.8) 中混匀，预热后依次加入20 μL 500 mg/L的菊酯类或有机磷类杀虫剂 (使反应体系中杀虫剂的终浓度为20 mg/L) 和50 μL GSH (100 μmol/mL，pH 7.0，现配现用) ，在37 °C 恒温水浴锅中孵育3 h。在反应体系中加入等体积的乙腈，再加入氯化钠使其饱和，振荡离心，上清液过0.22 μm 滤膜，用于UPLC 检测。仪器检测条件为流动相V(乙腈) :V(水) = 80 : 20，流速0.4 mL/min，进样体积5 μL，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C181.7 μm (2.1 mm × 100 mm) ，柱压48.9 MPa。高效氯氰菊酯是一种手性杀虫剂，在该检测条件下可分离为顺式氯氰菊酯 (alpha-cypermethrin) 和反式氯氰菊酯 (theta-cypermethrin) 。用光电二级阵列管检测器(photo-diode array，PDA)分别在220、220、230、280 和290 nm 处对氰戊菊酯、高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、辛硫磷和毒死蜱进行定量，以PBS 为对照，每个处理重复4 次。

1.6 表达菌株代谢活性测定

用转化SlGSTO2 的大肠杆菌测定其对菊酯类和有机磷类杀虫剂的代谢活性。从LB 固体培养基中挑取SlGSTO2 的单克隆菌落，在含有50 mg/L Kan 的LB 液体培养基 (25 mL) 中振荡培养24 h，并将其稀释为OD600= 1 的种子液低温保存。取200 mL 锥形瓶，加入50 mL LB 液体培养基 (含50 mg/L Kan，50 mg/L有机磷类或者25 mg/L 菊酯类杀虫剂) ，接入2 mL 种子液 (OD600= 1) 。将其在37 °C、120 r/min下振荡培养6 h 后，加入IPTG 诱导目的蛋白表达，分别于0、24、48、72、96 h 取样，样品的提取和仪器检测条件同1.5 节。以LB 液体培养基和转化了pET-26b(+)空载体的大肠杆菌为对照，每个处理重复4 次。

1.7 抑菌圈试验

以CHP 作为过氧化物源，采用抑菌圈试验测定SlGSTO2 是否具有抗氧化活性，具体方法参考Labade 等[24]。取0.2 mL OD600= 1 的种子液均匀涂布于LB 固体培养基 (含50 mg/L Kan 和1 mmol/L IPTG) 上，在37 ℃下培养1 h 后加入浸有不同浓度CHP (0、50、100、200、300 mmol/L，用丙酮配制) 的圆形滤纸 (直径5 mm) ，在37 °C 下培养24 h，测量抑菌圈直径。以只含表达载体pET-26b(+)的菌液为对照，如若处理组抑菌圈直径小于对照组，则表明SlGSTO2 具有抗氧化活性。每个浓度重复3 次，试验重复2 次。

1.8 数据分析

试验数据均采用SPSS 16.0 进行统计学分析，SlGSTO2 的体外代谢活性和抑菌圈试验均采用Student’st-test 进行显著性分析，SlGSTO2 的表达菌株代谢活性采用单因素方差的Duncan’s 分析法。

2 结果与分析

2.1 重组蛋白SlGSTO2 的SDS-PAGE

用SDS-PAGE 对SlGSTO2 的粗酶液和纯化蛋白进行电泳，结果如图2 所示。与转化空载体pET-26b(+)的大肠杆菌粗酶液 (Lane 1) 或含重组蛋白SlGSTO2 的大肠杆菌粗酶液 (Lane 2) 相比，IPTG 诱导的含重组蛋白SlGSTO2 大肠杆菌粗酶液 (Lane 3) 及其纯化后的重组蛋白SlGSTO2 (Lane 4) 在26 kDa 与33 kDa 之间有一条明显的条带，与SlGSTO2 的理论分子质量32.5 kDa (Compute pI/Mw，https://web.expasy.org/compute_pi/) 相符。

2.2 重组蛋白SlGSTO2 对菊酯类和有机磷类杀虫剂的体外代谢

将纯化的重组蛋白SlGSTO2 与菊酯类和有机磷类杀虫剂共孵育3 h 后，用UPLC 测定杀虫剂的残留量，以测定其体外代谢活性。结果表明，与PBS 相比，纯化后的重组蛋白SlGSTO2 仅显著降低了三氟氯氰菊酯的残留量，代谢率为5.2%，而对氰戊菊酯、顺式氯氰菊酯、反式氯氰菊酯、辛硫磷和毒死蜱等杀虫剂的残留量无显著影响(表2) 。

表2 纯化后的重组蛋白SlGSTO2 对杀虫剂的体外代谢活性Table 2 The metabolic activity of purified recombinant protein SlGSTO2 to insecticides in vitro

2.3 表达菌株对菊酯类和有机磷类杀虫剂的代谢

将菊酯类或有机磷类杀虫剂和含pET-26b(+)/SlGSTO2 的大肠杆菌种子液共同孵育，用UPLC测定杀虫剂的残留量。结果表明，与pET-26b(+)和LB 液体培养基处理后的残留量相比，转化了pET-26b(+)/SlGSTO2 的大肠杆菌与杀虫剂共同孵育后，所测杀虫剂的残留量均无显著变化 (图3) 。

2.4 SlGSTO2 的抗氧化活性

采用CHP 作为过氧化物胁迫源，测定了转化pET-26b(+)/SlGSTO2 的大肠杆菌的抗氧化活性。结果表明，随着CHP 浓度的升高，涂布转化pET-26b(+)和pET-26b(+)/SlGSTO2 大肠杆菌的LB 平板中滤纸片抑菌圈直径均逐渐增大 (图4A 和4B) 。但是与涂布转化pET-26b(+)的大肠杆菌相比，涂布转化pET-26b(+)/SlGSTO2 大肠杆菌的LB 平板的滤纸片抑菌圈直径显著减小 (图4A) ，当CHP浓度分别为50、100、200 和300 mmol/L 时，其抑菌圈直径较涂布pET-26b(+) 的分别减小了38.7%、47.1%、50.7%和42.6% (图4A) 。

3 讨论与结论

目前针对GSTs 基因在昆虫抗性中的功能研究多集中在Delta 和Epsilon 家族，对Omega 家族的GSTs 基因功能研究相对较少。本课题组前期研究发现，在田间采集的4 个抗菊酯类杀虫剂的斜纹夜蛾种群中，SlGSTO2基因均呈现显著的过量表达[19]，为了研究该基因和杀虫剂抗性的关系，本文构建了大肠杆菌pET-26b(+)/SlGSTO2 表达载体，并对其代谢活性和抗氧化活性进行了研究。

一般认为，在抗性种群中上调表达的基因预示着其可能参与了对杀虫剂的抗性，但二者之间并无确定的关联，仍需进行进一步的功能验证。本研究结果表明，将斜纹夜蛾SlGSTO2基因在大肠杆菌中成功表达后，并没有检测到其对氰戊菊酯和高效氯氰菊酯等杀虫剂的代谢活性，仅对三氟氯氰菊酯有微弱的体外代谢，代谢率为5.2%。GSTs 被广泛报道可以直接代谢有机磷类杀虫剂[9-10,25-26]，本研究发现，SlGSTO2 对常用的有机磷类杀虫剂辛硫磷和毒死蜱均无代谢作用。目前，在其他昆虫中也未见有Omega 家族GSTs 直接参与杀虫剂代谢的研究报道。家蚕Bombyx mori中肠中的GSTO2基因可以显著地被氰戊菊酯诱导表达，推测其可能与家蚕对氰戊菊酯的耐受性有一定关系[27]。

GSTs 广泛参与菊酯类杀虫剂抗性的形成[28]，尽管尚未能检测到GSTs 催化菊酯类杀虫剂与GSH反应的轭合产物[29]，但GSTs 可以通过清除过氧化物或直接与菊酯类杀虫剂结合进行区域化隔离等方式介导抗性的产生[30-31]。本研究通过抑菌圈试验结果表明，表达pET-26b(+)/SlGSTO2 的大肠杆菌可以显著缩小由CHP 处理引起的抑菌圈直径，说明其具有显著的抗氧化活性。Yamamoto 等[32]的研究结果表明，家蚕Omega 家族的GSTs 基因可以被多种环境胁迫诱导表达，表明该家族基因可能增加了家蚕对环境胁迫的耐受性。中华蜜蜂Apis cerana cerana中AccGSTO2基因可以被紫外线、过氧化氢和杀虫剂等非生物胁迫诱导表达，纯化的重组蛋白AccGSTO2 具有依赖谷胱甘肽的脱氢抗坏血酸还原酶和抗氧化物酶活性；将该基因沉默，可以显著降低过氧化氢酶(catalase，CAT)和谷胱甘肽还原酶活性，增加过氧化氢、丙二醛和羰基含量，说明该基因可以通过抗氧化活性减少氧化损伤[33-34]。在禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi中，RpGSTO1 重组蛋白可以消除CHP 诱导的氧化损伤，具有显著的抗氧化活性[35-36]。

大量国内外研究表明，杀虫剂能诱导昆虫引起氧化应激导致脂质过氧化反应[32,37-39]，如使家蚕直接接触二嗪磷、氯菊酯和吡虫啉，可明显增加虫体内过氧化氢含量[32]。Vontas 等[29,40]对褐飞虱Nilaparvata lugens的研究发现，用菊酯类药剂汰选得到的抗性种群GSTs 酶活性升高，但纯化的GSTs 蛋白对菊酯类药剂或其初级代谢产物均没有代谢活性；进一步研究发现，抗性种群中的NlGST1-1 活性提升可以有效地清除因菊酯类药剂暴露引起的过氧化物，减少脂质过氧化。据李周直等[41]报道，用溴氰菊酯处理菜粉蝶Pieris rapae10 min 后，该虫体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、CAT 和过氧化物酶 (peroxidase，POD)的活性均高于对照；而处理边绿刺蛾Parasa consocia和褐刺蛾Thosea pastornata后，SOD 和CAT 活性随虫体中毒程度加重而不断上升，接近死亡时又急剧下降，这表明在逆境下昆虫可通过提高体内抗氧化活性来适应对外界毒害的影响。本研究发现，斜纹夜蛾SlGSTO2 仅对三氟氯氰菊酯有微弱的体外代谢活性，同时还具有明显的抗氧化活性，推测其可通过抗氧化活性缓解杀虫剂对害虫造成的氧化损伤而参与抗性形成。