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浙江省西 (甜) 瓜蔓枯病菌对甲基硫菌灵和啶酰菌胺的抗性检测及抗性机制

2021-12-23吴倩倩庄超杰吴鉴艳张传清

农药学学报 2021年6期
关键词:瓜蔓抗药性杀菌剂

吴倩倩, 庄超杰, 吴鉴艳, 张传清

(浙江农林大学 现代农学院,杭州 311300)

西瓜Citrullus lanatus和甜瓜Cucumis melo均为葫芦科 (Cucurbitaceae) 经济水果,在蔬菜瓜果产业中占有重要地位[1]。2019 年浙江省西 (甜) 瓜收获面积和产量分别为8.28 万公顷和246.7 万吨,占全国西 (甜) 瓜收获面积和产量的4.28%和3.26%[2]。作为一种世界范围内的重要侵染性病害,蔓枯病在西 (甜) 瓜整个生长发育阶段均可发病,会对产量和品质造成严重影响。田间植株的发病率一般在20%~40%之间,在温室种植和连作时,植株发病率可高达80%,藤蔓发病率约为10%。危害严重时,减产率甚至能达15%[3]。

化学防治是目前防治蔓枯病的主要措施之一。过去中国常使用苯并咪唑类杀菌剂多菌灵和甲基硫菌灵防治西甜瓜上包括炭疽病、枯萎病和蔓枯病等多种病害,在田间表现出了良好的防治效果[4],但由于该类杀菌剂的作用位点单一,连续大面积使用,病原菌极易对其产生抗性[5],而蔓枯病在西 (甜) 瓜整个生育期内均可发生,在长期的施药过程中,蔓枯病菌也可能对该类药剂产生抗性。琥珀酸脱氢酶抑制剂类 (SDHIs) 杀菌剂的代表品种啶酰菌胺对蔓枯病菌具有较好的防治效果。

苯并咪唑类杀菌剂主要通过作用于真菌微管的功能和组装,最终抑制细胞的有丝分裂[6-7]。有研究表明,植物病原真菌在田间对这类杀菌剂产生抗性的机制主要为其β-tubulin基因的第198 位和200 位密码子的点突变[8]。SDHIs 杀菌剂作用于真菌琥珀酸脱氢酶[9],目前报道的抗药性菌株的突变位点主要发生在Sdh B,其次为Sdh C 和Sdh D。2015 年,Hendricks 等[10]研究发现,佛罗里达州西瓜蔓枯病菌对啶酰菌胺产生抗性是由于其Sdh B上的H277Y 或H277R 突变导致的,这与2012 年Avenot 等[11]报道的西瓜蔓枯病菌对啶酰菌胺的抗性机制一致。本研究检测了浙江省蔓枯病菌对甲基硫菌灵和啶酰菌胺的抗性,并分析了抗药性机制,以期为生产中蔓枯病菌对两种药剂的抗性管理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试培养基及药剂

培养基:马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 培养基:去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL。

药剂:97%甲基硫菌灵 (thiophanate-methyl,以下简称Ben) 原药,由江西正邦生物化工股份有限公司提供;97%啶酰菌胺 (boscalid,以下简称Bos) 原药,由浙江天一农化有限公司提供。均用丙酮作溶剂,啶酰菌胺配制成5 × 104μg/mL 的母液,甲基硫菌灵配制成2 × 104μg/mL的母液,于4 ℃下贮存,备用。

1.2 菌株采集与分离

从浙江省台州、温州、金华、湖州和宁波5 市的西 (甜) 瓜大棚或田块采集蔓枯病发病的茎和叶,每个大棚或田块采集1~5 株,每个病样用采样袋单独包装。采用组织分离法[12]从病健交界处切取5 mm × 5 mm 组织块,依次用质量分数为75%的酒精消毒30 s、3%的次氯酸钠消毒3 min,最后用ddH2O 水冲洗3 次。根据蔓枯病菌的菌落形态,挑取菌落边缘菌丝在PDA 上重复转接培养、纯化,最终分离得到蔓枯病菌112 株[3]。对甲基硫菌灵敏感的蔓枯病菌菌株HC-1 和HC-11,由西南大学毕朝位馈赠。

1.3 抗药性检测

1.3.1 对甲基硫菌灵的抗性 采用区分剂量法[13]。将从浙江省5 市分离获得的112 株田间菌株,在25 ℃培养3 d 后,打取直径为5 mm 的菌碟,分别接种在含甲基硫菌灵5 和100 μg/mL的PDA 平板上,以含相同体积丙酮但不含药剂的PDA 平板为对照。试验重复3 次。于25 ℃培养箱中培养3 d,观察菌株生长情况。根据菌株不同生长表型定义为:在5 μg/mL 甲基硫菌灵上不能生长的为甲基硫菌灵敏感 (定义为BenS) 菌株,在100 μg/mL 的甲基硫菌灵上能生长的为甲基硫菌灵高水平抗性(BenHR) 菌株[13]。按公式 (1) 计算抗药性频率。

式中:FR为抗药性频率;NR为抗药性菌株数;NT为总菌株数。

1.3.2 对啶酰菌胺的抗性 如上将分离获得的菌株分别接种在含啶酰菌胺10、50 和100 μg/mL[14-15]的PDA 上,以含相同体积丙酮的PDA 平板为对照,重复3 次。于25 ℃培养箱中培养3 d,观察菌株生长情况。根据菌株不同生长表型定义为:在10 μg/mL 啶酰菌胺上不能生长的为啶酰菌胺敏感 (BosS) 菌株;在10 μg/mL 的啶酰菌胺上能生长,但在50 μg/mL 下不能生长的为啶酰菌胺低水平抗性 (BosLR) 菌株;在50 μg/mL 啶酰菌胺上能生长,但在100 μg/mL 下不能生长的为啶酰菌胺中水平抗性 (BosMR) 菌株,在100 μg/mL 啶酰菌胺上能生长的为啶酰菌胺高水平抗性 (BosHR) 菌株[14-15]。

1.4 抗药性分子机制分析方法

1.4.1 对甲基硫菌灵的抗性机制 蔓枯病菌的βtubulin基因引物参考刘顺涛[16]的方法。引物序列为:CQ59: 5′-TGGTGCTGGTAACAACTG-3′,CQ: 60 5′-GTCCTCGACCTCCTTCAT-3′,由杭州有康生物科技有限公司合成。以提取的西 (甜) 瓜蔓枯病菌的DNA 为模板进行PCR 扩增β-tubulin的基因序列。β-tubulin基因序列的反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共35 个循环;最后72 ℃延伸10 min;4 ℃停止反应。

1.4.2 对啶酰菌胺的抗性机制 蔓枯病菌的SdhB基因引物参考王少秋等[17]的方法。引物序列为:CQ62: 5′-CTTGTCCCTGACATGACACTT-3′,CQ63: 5′-TCCTTGAGCAGTTGAGAATGG-3′,由杭州有康生物科技有限公司合成。以提取的西 (甜) 瓜蔓枯病菌的DNA 为模板进行PCR 扩增部分SdhB的基因序列。SdhB基因序列的反应程序:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共35 个循环;最后72 ℃延伸10 min;4 ℃停止反应。

2 结果与分析

2.1 西(甜)瓜蔓枯病菌对甲基硫菌灵和啶酰菌胺的抗性情况

通过区分剂量法检测了从浙江省5 地采集的112 株蔓枯病菌对甲基硫菌灵和啶酰菌胺的抗性。结果显示:112 株蔓枯病菌均能在含100 μg/mL 甲基硫菌灵的PDA 培养基上生长,均为对甲基硫菌灵产生高水平抗性 (BenHR) 的菌株,未检测到低水平抗性 (BenLR) 及敏感 (BenS) 菌株,表明供试菌株对甲基硫菌灵的抗性频率已达100%。而对于啶酰菌胺,在112 株蔓枯病菌中:共有80 株菌株对啶酰菌胺表现敏感 (BosS);32 株菌株表现出抗性(BosR),抗性频率为28.6%,其中有21 株表现出低水平抗性 (BosLR),抗药性频率为18.8%;有11株表现出高水平抗性 (BosHR),抗药性频率为9.8%;未发现对啶酰菌胺产生中水平抗性 (BosMR) 的菌株。

从蔓枯病菌的不同寄主来看,西瓜和甜瓜上BenHR菌株的频率均为100%。对于啶酰菌胺:西瓜上对其已产生抗性的菌株 (BosR) 的频率为28.4%,其中包含22.4%的BosLR菌株和6.0%的BosHR菌株;而甜瓜上BosR、BosLR和BosHR频率分别为28.9%、13.3%和15.6%,BosHR菌株的比例略高于西瓜上的。

2.2 西(甜)瓜蔓枯病菌对甲基硫菌灵的抗性机制

通过引物CQ-59 和CQ-60 对甲基硫菌灵敏感(2 个) 和抗性 (2 个) 菌株的β-tubulin基因片段进行PCR 扩增,获得了长度为654 bp 的PCR 产物。然后通过软件DNAMAN 6.0 对其序列进行比对,发现主要有6 个位点碱基发生了改变 (图1)。其中主要涉及到第354 位碱基由C 变为T、第447 位碱基由C 变为T、第534 位碱基由C 变为T,第663 位碱基由C 变为T,但它们相应的氨基酸没有发生改变,均属于同义突变。只有第593位碱基由A 变成C 时,相应的第198 位氨基酸发生了改变 (表1)。通过软件DNAMAN 6.0 将所得碱基序列翻译成氨基酸序列后,再将其氨基酸进行比对,发现抗药性菌株的第198 位的氨基酸由Glu (E) 突变为Ala (A)。

表1 甲基硫菌灵敏感、高抗性菌株部分β-tubulin 基因及氨基酸的突变位点Table 1 The part of β-tubulin gene and amino acids mutation of sensitive and high resistant strains

2.3 西(甜)瓜蔓枯病菌对啶酰菌胺的抗性机制

通过引物CQ-62 和CQ-63 对BosS菌株 (2个)、BosLR(2 个) 和BosHR菌株 (2 个) 菌株的部分Sdh B基因进行PCR 扩增,获得了长度为367 bp的PCR 产物。将所得序列通过软件DNAMAN 6.0 进行比对,发现第550 位碱基由C 变为T (图2),相应第277 位氨基酸由组氨酸 (His) 突变为酪氨酸 (Tyr) (表2)。通过软件DNAMAN 6.0将所得碱基序列翻译成氨基酸序列后,再将其进行比对,发现抗性菌株的第277 位氨基酸由His (H) 突变成Tyr (Y)。

表2 啶酰菌胺敏感、低抗和高抗菌株部Sdh B 基因及氨基酸的突变位点Table 2 The part of SdhB gene and amino acids mutation of low and high resistant and sensitive strains

3 结论与讨论

浙江省西 (甜) 瓜蔓枯病发生严重,苯并咪唑类杀菌剂和SDHIs 杀菌剂是西 (甜) 瓜病害防治的常用药剂,但在浙江省还未见其抗药性的相关研究报道。本研究于2019 年6 从浙江省5 地采集了112 株蔓枯病菌,采用区分剂量法检测了其对苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵 (Ben) 和SDHIs 杀菌剂啶酰菌胺 (Bos) 的抗性情况。结果显示:112 株蔓枯病菌对供试2 个杀菌剂的抗药性频率分别为100%和28.6%,其中对甲基硫菌灵产生高水平抗性 (BenHR) 的菌株达到100%,对啶酰菌胺产生低水平抗性 (BosLR) 和高水平抗性 (BosHR) 的菌株分别为18.8% 和9.8%。在分离自西瓜的蔓枯病菌中,包含22.4%的BosLR和6.0%的BosHR菌株;而在分离自甜瓜的蔓枯病菌中,BosLR和BosHR分别占13.3%和15.6%,两者抗药性频率相近,但甜瓜蔓枯病菌高水平抗性菌株 (BosHR) 的比例略高。已有研究报道,在中国重庆、贵州地区已经发现西瓜蔓枯病菌对多菌灵的抗性,其中重庆武隆地区多菌灵的抗性频率已达98.5%,但尚未见蔓枯病菌对啶酰菌胺产生田间抗性的报道[18]。

刘顺涛[16]发现,蔓枯病菌对多菌灵产生抗性的机制是其β-tubulin 上发生了E198A 点突变。王少秋[18]报道,通过实验室诱导获得的蔓枯病菌对啶酰菌胺的抗性突变体的抗性机制为Sdh B 上H277Y 点突变。本研究结果显示:田间BenHR菌株的抗性机制为β-tubulin 第198 位氨基酸由Glu(E) 突变为Ala (A);田间BosHR菌株的抗性机制是Sdh B 的第277 位氨基酸由His (H) 突变成了Tyr (Y),但是田间BosLR的抗性机制尚不清楚。本研究验证了刘顺涛的结论,同时在王少秋的基础上明确了田间BosHR的蔓枯病菌是由于Sdh B上H277Y 突变导致的。

Stevenson 等[19]研究发现,西瓜蔓枯病菌田间BosR菌株在Sdh B 亚基第277 位上的氨基酸由组氨酸 (H) 突变为酪氨酸 (Y)。Avenot 等[20]发现,开心果晚疫病菌Alternaria alternata的BosHR菌株Sdh B 序列的277 位上的组氨酸突变为了酪氨酸或精氨酸;皇甫运红[21]发现,浙江省草莓灰霉病菌Botrytis cinerea对啶酰菌胺抗性菌株 (BosR) 的抗性分子机制为Sdh B 的S244T 突变和H277T 或H277R 双重突变。除了Sdh B 亚基发生突变外,SDHIs 抗性问题的产生还可能与Sdh C 和Sdh D亚基上突变有关。2008 年,Ishii 等[22]报道,日本田间检测到的黄瓜褐斑病菌Corynesporasp. 的BosMR菌株的突变位点有Sdh C (S73P) 和Sdh D(S89P, G109V)。2019 年,Pearce 等[23]研究发现,在除虫菊褐色斑点病菌Didymella tanaceti的BosMR菌株中,突变位点有Sdh B (I279V)、Sdh C(H134Q) 和Sdh D (D112E)。除靶标位点基因发生突变外,还有研究认为靶标基因表达的上升或下调可能导致指状青霉菌Penicillium digitatum对啶酰菌胺产生抗性[24]。此外,外排系统中的ABC 转运蛋白或MSF 转运蛋白基因的过量表达也会使灰霉病菌对包括啶酰菌胺在内的多种SDHIs 杀菌剂产生低到中等水平抗性[25-26]。由于本研究只扩增了Sdh B基因的部分片段,BosLR菌株产生抗性的原因可能是在未扩增的片段产生了突变位点,也可能是靶标基因的表达上升或下调。此外,外排机制或许也可能够与本研究中对啶酰菌胺表现出低水平抗性有关,但具体抗药性机制还有待进一步研究。

总之,本研究表明,浙江省西(甜)瓜蔓枯病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性已十分严重,应停止该类药剂在西(甜) 瓜病害防治中的田间应用。大多数菌株对啶酰菌胺表现敏感,但在一些地区存在高抗菌株,应注意科学使用杀菌剂,并加强抗药性监测。

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