纳米银的绿色合成、杀虫活性和作用机制研究进展

谢晓俊, 羊桂英, 周琪欢, 朱娅宁, 莫建初

(浙江大学 昆虫科学研究所，农业农村部农业昆虫学重点实验室，浙江省作物病虫生物学重点实验室，杭州 310058)

纳米技术是一门交叉性强的综合学科，纳米材料具有常规材料所不具备的独特性质和功能，使其在工程、光电、生物医学、环保、药理学及可持续农业等领域的应用备受关注[1-6]。纳米材料的制备和研究是整个纳米技术的基础。传统的化学制备方法具有高能耗、不稳定、步骤繁琐、使用的溶剂毒性强、污染严重、对环境和非靶标生物存在潜在危害等弊端[7]，使得研究者逐步将研究重点转向绿色合成[8]。金属纳米被认为是生物医学、农业研究等领域最具有发展前景的纳米颗粒之一[9]。在金属纳米材料中，以纳米银(AgNPs)的研究最为深入。纳米银的绿色合成主要是利用真菌、细菌培养上清液以及植物提取物的某些组分或纯代谢物作为还原剂和稳定剂，将硝酸银中的Ag+还原为纳米级别的银单质[10]。与传统制备方法相比，绿色合成方法操作简单、成本低，不需要使用有毒化学物质，并且有助于降低能耗，推进环境可持续发展[11]。因此，利用生物源介导合成纳米银成为了目前纳米材料合成研究的一大热点。近年来，有报道称生物源合成的纳米银具有杀虫活性。考虑到传统杀虫剂所引起的害虫耐药性增加、化学残留物的积累及对人类健康和环境的不利影响，新型绿色农药的开发和应用迫在眉睫。本综述以纳米银的绿色合成作为切入点，基于近年来国内外研究报道，对采用不同生物资源合成纳米银的现状和合成方法进行了归纳总结，讨论了纳米银的杀虫活性和目前已知的杀虫作用机理，分析了生物源合成的纳米银对人类健康和生态环境的潜在风险，并对未来纳米银的绿色合成可能面临的机遇和挑战进行了展望，以期为新型生物源合成纳米银农药的研发和工业化生产提供有价值的参考。

1 合成纳米银的生物资源

1.1 微生物

由微生物介导的纳米银的绿色合成包括细胞内(生物质)和细胞外(细胞提取物)两种方式[12]。细胞外合成由于操作简便，免除了下游回收纳米银的繁琐程序而受到高度关注[10]。目前利用微生物介导合成的纳米银的研究大多属于胞外合成，发挥重要作用的是由菌体分泌产生的胞外酶、还原性辅酶、多肽类及其他次级代谢物质，它们可作为稳定剂和还原剂参与金属离子的还原反应[13]。大多数微生物具有对金属的高耐受性及细胞内的金属吸收能力[14]，这一特点增强了微生物与金属离子的亲和力和结合力。另外，微生物不仅易生长、繁殖速度快、还具备高度的可操纵性，具有通过控制菌体培养条件调节微生物代谢，从而统一优化合成纳米银的粒径、形状和聚集程度等特性。截至目前，已经有几十种微生物资源被用于合成纳米银，部分最新研究成果列于表1。

表1 AgNPs 绿色合成的微生物资源Table 1 Microbial resources for green synthesis of AgNPs

1.2 植物

植物的各部分中含有多糖、脂质、蛋白质、酶、生物碱、单宁、酚类、皂苷及萜类等化学成分[21]。这些化学分子经过重组，在纳米银合成中作为还原剂和稳定剂，将硝酸银溶液中的Ag+还原成纳米级别的银单质。由于植物合成纳米银大多以水作为溶剂，因此合成过程绿色无毒、快速高效[22]。与微生物相比，利用植物合成纳米银不要求无菌条件，降低了培养和维护成本，操作更加简便，生物危害小，大大提高了工业生产可行性[21]。这些特点使得植物提取物介导纳米银合成具有极大的发展前景。截至目前，已有上百种植物资源被用于胞外合成纳米银的研究，部分最新研究成果如表2 所示。

表2 AgNPs 绿色合成的植物资源Table 2 Plant resources for green synthesis of AgNPs

2 纳米银的绿色合成方法

2.1 微生物介导的绿色合成

常用的微生物介导下合成纳米银的流程图见图1。

在细胞外合成中，以蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusA1-5 为例，首先将菌液在琼脂培养基中于35 ℃振荡(150 r/min)培养120 h 后，以12 000 r/min 离心，收集底部沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀以去除培养基的剩余成分。然后取10 g 芽孢杆菌沉淀与100 mL 蒸馏水在30 ℃下混合均匀，72 h后利用Whatman No.1 滤纸过滤混合液，收集滤液；向90 mL、1 mmol/L 的硝酸银溶液中逐滴滴入10 mL 芽孢杆菌滤液，于30 ℃、150 r/min的黑暗条件下孵育24 h，最终混合液颜色从无色变成黄褐色是纳米银合成的第一个指标；进一步表征结果显示：纳米银分散良好，呈球形，粒径在6～50 nm 之间[18]。

2.2 植物提取液介导的绿色合成

基于植物提取液介导合成纳米银的研究，在纳米银绿色合成中占据重要地位。利用植物合成纳米银的方法 (以腊肠树果实为例) ：先破果壳收集果肉，室温干燥后置于烘箱内2～3 d，待烘干后磨成粉末，过40 目筛 (孔径0.425 mm) ；取10 g果肉粉末于100 mL 蒸馏水中 60 ℃浸煮，混合液经Whatman No.1 滤纸过滤纯化得到果肉滤液，作为合成纳米银的起始材料；向200 mL、3 mmol/L的硝酸银溶液中逐滴滴入50 mL 提取液，混匀后置于80 ℃水浴中加热，混合液由无色变成深棕褐色，随后利用紫外吸收可见光谱仪 (UV-Vis) 扫描出现特征峰 (400～450 nm) ，如图2 所示，初步确认纳米银的生成[28]；最后通过扫描电镜 (SEM) 、透射电镜 (TEM) 、能量色散X 射线光谱仪 (EDX)和傅里叶红外光谱仪 (FTIR)对纳米银进一步表征，结果如图3 和图4 所示[28]，生成的纳米银大多呈球形、粒径均匀、样品中银单质含量较高且官能团多样。

与微生物介导合成纳米银相比，利用植物合成纳米银的方法更简便、易操作，原料无毒、可扩展性强，可避免微生物培养过程中有害生物的侵入等问题，节省了合成成本，更易满足纳米银在生物医学和环境领域的高需求。因此，目前在纳米材料的绿色合成中，利用植物原料合成的研究更广泛。

3 生物源合成纳米银的杀虫活性及其作用机理

3.1 生物源合成纳米银的杀虫活性

目前，生物源合成的纳米银用于害虫防治的研究主要集中在危害公共卫生健康的媒介害虫和影响经济生产的农业害虫两方面。

3.1.1 媒介害虫 蚊虫作为媒介害虫的典型代表，可传播疟疾、寨卡、登革热和黄热病等疾病。青蒿素在临床上用于治疗疟疾。据WHO 报道，部分地区的临床数据显示已产生抗药性[29]。因此，蚊媒疾病仍是全世界人口健康的巨大威胁。目前，对蚊虫的防控措施主要有物理防治(纱帐)、化学防治(驱蚊剂) 和生物防治(自然天敌)等，但广泛应用的还是化学防治[30]。

21 世纪以来，随着生物资源介导合成纳米银工作的开展，一些研究者期望将纳米银应用到危害公共卫生健康的蚊媒控制上，先后测试了生物源合成的纳米银对多种蚊虫幼虫、蛹和成虫的毒性。Amerasan 等[31]测定了利用绿僵菌Metarhizium anisopliae制备的纳米银对疟疾媒介库态按蚊Anopheles culicifacies的急性毒性，发现纳米银对库态按蚊幼虫和蛹的LC50值分别为32.8 mg/L (Ⅰ龄)、39.8 mg/L (Ⅱ龄)、45.9 mg/L (Ⅲ龄)、51.9 mg/L(Ⅳ龄)和60.0 mg/L (蛹)，说明较低剂量的纳米银就会导致库态按蚊各龄期的幼虫和蛹死亡。Govindarajan 等[32]利用白桦叶提取液作为还原剂合成纳米银，发现其对传播疟疾的浅色按蚊Anopheles subpictus、传播登革热的白纹伊蚊Aedes albopictus及传播日本脑炎病毒的三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus的三龄幼虫均有毒性效应， LC50值分别为12.53、13.42 和14.61 mg/L，远低于白桦叶提取液处理的 LC50值 (61.23、64.97 和70.72 mg/L) ，且在较高浓度下对摇蚊、仰椿和食蚊鱼这3 种非靶标生物只有很低的毒性。Kumar 等[33]也发现，利用止泻木树皮合成的纳米银对温中剑水蚤Mesocyclops thermocyclopoides这一非靶标生物低毒。该团队还发现，利用欧洲蕨叶提取液合成的纳米银可降低斯氏按蚊Anopheles stephensi的繁殖能力和寿命，与氯喹相比，对恶性疟原虫有更好的抑制效果[34]。进一步研究发现，在相同浓度下，用印楝种子仁提取液合成的纳米银对小鼠体内伯氏疟原虫的抑制效果也分别高于单独使用印楝种子仁提取液和氯喹的效果，且抗疟原虫的活性与剂量呈正相关，即随着纳米银浓度增加，抗疟原虫活性提高[35]。

蝇类具有发育阶段明显、生命周期短及遗传结构清晰等特点，也是研究纳米银毒性的理想生物。Ong 团队[36]发现，纳米银会降低果蝇睾丸中生殖干细胞的数量并诱导精子产生缺陷，导致发育延迟，甚至存活率显著下降等。Raj 等[37]也发现，喂食纳米银的黑腹果蝇成虫的存活率、寿命、卵巢大小和产卵能力均显著降低，且纳米银的毒效存在跨代效应，即在早期幼虫阶段摄食纳米银会影响下一代。纳米银还会破坏黑腹果蝇幼虫神经干细胞和非神经元细胞的遗传物质[38]。随后有研究者利用由内生链霉菌上清液制备的纳米银处理家蝇后，家蝇出现急性中毒，且家蝇对低浓度纳米银的敏感度略低于淡色库蚊，但纳米银对家蝇幼虫的毒杀活性要高于普通杀虫剂的杀幼虫活性[39]。

除蚊、蝇外，在蜱螨防治上也开展了一定的研究。 研究人员在微小牛蜱Rhipicephalus(Boophilus)microplus幼虫包裹试验中发现，与单独使用溴氰菊酯(LC50值为 49.71 mg/L)相比，将溴氰菊酯与由印楝叶制备的纳米银联合使用(LC50值为3.87 mg/L)，在较低浓度下就能产生较高的杀螨效果，且联合使用时可降低蜱虫的产卵量和孵化率[40]。另有试验发现，相同浓度下纳米银对番茄刺皮瘿螨Aculops lycopersici和二斑叶螨Tetranychus urticae的杀灭效果显著，卵孵化率明显降低，而对其捕食性天敌植绥螨影响不大[41]。

3.1.2 农业害虫 截至目前，采用生物源合成的纳米银防治害虫的研究大多集中于公共卫生害虫，在农业害虫方面的研究相对较少。2018 年，Suresh 等[42]发现，以海滨碱蓬叶提取液制备的纳米银对斜纹夜蛾Spodoptera litura的幼虫和蛹存在较高毒性， LC50达到20～46 mg/L；利用狮耳花提取液合成的纳米银对斜纹夜蛾和棉铃虫幼虫都有高致死性，经150 mg/L 的纳米银处理96 h 后，幼虫最大死亡率分别为78.49%和72.70%[43]。Kamil等[44]的研究表明，纳米银对菜缢管蚜Lipaphis erysimiKalt. 也具有较高毒性，以25 株球孢白僵菌为原料制备的纳米银处理菜蚜96 h 后，菜蚜死亡率最高达60.88%。随后，在对棉蚜的试验也发现，利用美洲大蠊翅提取物合成的纳米银处理后，棉蚜的平均死亡率约为40%[45]。此外，Vadlapudi 等[46]研究了生物源合成的纳米银对赤拟谷盗Tribolium castaneum、谷蠹Rhyzopertha dominica、米象Sitophilus oryzae这3 种储粮害虫的毒杀活性。结果发现，纳米银对3 种储粮害虫都只有中度的抑制活性。与之前报道的对蚊虫的高毒活性相比，纳米银对3 种储粮害虫的抑制性较低，这可能与它们具有较厚的角质层，导致低剂量的纳米粒子较难穿透其表皮发生作用有关。

3.2 纳米银的杀虫机理

为探究生物源合成的纳米银在害虫防治方面的潜力，预测纳米银作为杀虫剂在实际应用中所产生的毒理学后果，推动新型纳米杀虫剂的实质性进展，阐明纳米银对害虫的作用机理至关重要。目前的研究认为DNA 损伤、蛋白质失衡、酶失活及物理损伤等都可能是纳米银对害虫潜在的作用机制，如图5 所示。

纳米银对害虫的毒性受到其粒径、形状、聚集程度及其所带电荷的影响[47]。粒径小的纳米银可与细胞膜上蛋白质中的磷和核酸中的硫结合，使得细胞膜透性降低，从而造成细胞器功能丧失和酶失活，最终导致害虫死亡[30]。也有研究者认为，自由基的大量积累和DNA 损伤，引起活性氧(ROS)介导的细胞凋亡可能是纳米银对害虫的作用机制之一[48]。Nair 等[49]发现，经纳米银处理后的摇蚊，其核糖体蛋白基因(CrL15)下调，导致蛋白质合成降低，从而引发慢性毒性；同时，与氧化应激发生有关的谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因表达发生不同程度的改变，推测纳米银可能通过改变相关酶基因的表达，从而引发氧化应激[50]。另外，Fouad 等[28]发现，纳米银还能显著降低乙酰胆碱酯酶和α-和ß-羧酸酯酶的活性，而乙酰胆碱酯酶活性降低将造成胆碱能神经末梢释放的乙酰胆碱(ChE)不能被及时水解而大量积聚，导致神经高度兴奋，引发神经中毒，而酯酶是通过裂解羧酸酯和磷酸二酯键而参与化学杀虫剂抗性机制发展的主要酶，表征高抗性，所以α-和ß-羧酸酯酶的活性降低，表明昆虫抗性下降，导致昆虫的敏感性下降。

除此以外，研究者还发现纳米银造成的物理损伤也可能是潜在的作用机制。Fouad 等[51]用两种芽孢杆菌上清液胞外合成的纳米银对淡色库蚊Culex pipiens pallens进行了处理。结果发现，4 龄幼虫形态改变，胸腹部变化明显，肛乳头区和角质层损伤严重，蛹的头胸腹也发生了明显的畸变。Ga’al 等[52]则发现，利用沉香精油合成的纳米银对埃及伊蚊Aedes aegypti的中肠上皮细胞和刷状缘上微绒毛的影响较大，表现为中肠上皮细胞破裂，细胞核退化，上皮细胞严重受损，刷状缘损伤，出现空泡等。Banumathi 等[53]观察的形态变化与Ga’al 等发现的一致，并且还发现经纳米银处理后，埃及伊蚊3 龄幼虫出现躯体萎缩和外部刚毛缺失；组织病理研究结果显示，幼虫中肠和盲肠完全破裂，从而导致虫体崩塌裂解。

目前已知的生物源合成的纳米银防治害虫的作用机理大多来源于蚊媒，而纳米银对其他媒介害虫和农业害虫如何发挥毒性作用鲜少涉足。并且，纳米银粒径、形状和电荷对各种作用机制的具体影响也有待阐明。鉴于大多研究开展的是短期的急性毒性测定，这将不利于对纳米银毒性作用机理的深入探索。后续应开展纳米银的长期毒性试验，更有利于发现其对害虫的慢性毒性影响，从而开展广泛的纳米银毒性机制探讨。

4 生态毒理

纳米技术的迅速发展，使得纳米材料在生物医学和工业生产等领域应用十分广泛。因此，基于纳米材料潜在风险的研究就显得十分必要。为了研究纳米粒子的毒性，有研究者以几种常见田间植物和小鼠为模型，对比研究了化学方法和绿色合成法制备的纳米银，对6 种植物(黑麦草、小麦、蚕豆、野豌豆、莴苣和油菜)的种子萌发和幼苗生长的影响以及对小鼠间充质干细胞的毒性作用。结果发现，绿色方法合成的纳米银对植物的毒性和小鼠的细胞毒性明显低于化学合成的纳米银[54]，进一步佐证了生物源合成的纳米银具有绿色低毒的特性。Ahamed 等[55]也发现，利用大蒜瓣合成的纳米银对人肺上皮A549 细胞活力、细胞膜完整性和细胞内活性氧的产生无影响。然而，有研究显示，小麦根尖细胞很容易内化纳米银，从而影响细胞的正常功能[56]。另外，考虑到鱼类会生物累积水环境中的微量污染物，那么纳米银的潜在释放也可能通过食用鱼类影响人类健康，并且影响生态环境。但是目前对于纳米银使用后与生态系统的相互作用关系还不清楚[57]。因此，开展生物源合成的纳米银的生态毒理研究以及拓展使用后的动态监测，将对评估纳米银相关的环境风险等起到至关重要的作用。

5 展望

目前纳米材料的应用已经涉及医学、农业、催化以及生物传感等诸多领域，亟待大规模的生产以满足未来庞大的市场需求。与传统化学、物理法合成纳米材料相比，绿色合成法具有更好的可持续性和环境安全性[58]，其低能耗、耗时短、低成本和高效益也显示出了大规模工业化生产的巨大潜力。

纳米材料的绿色合成因其底物低廉、合成流程简单、无需昂贵设备等特点，以及在抑菌和抗虫等方面表现出的优良性能为重要害虫的防控提供了新的思路。但是，我们对该领域的研究仍然不够透彻，很多重要问题仍亟待解决。1) 纳米银的研究大多集中于蚊蝇等媒介害虫，对其他害虫的探索和研究不足；2) 绿色合成法涉及到生物资源种类、硝酸银浓度、反应温度、酸碱度和时间等变量，制备得到的纳米银的形状、粒径和聚集度等理化性质存在一定差异，不同的合成流程对纳米银的理化性质也有很大影响，而理化性质又直接影响其毒性[59-64]，从而限制对纳米银抗虫的稳定性和统一性的判断；3) 当前纳米银抗虫作用机制以及对有益生物的研究数据不足，影响后续的安全性评估，使得纳米银暴露在自然环境中对包括人类在内的非靶标生物以及环境产生的毒性不易预测。因此，为了促进新型纳米杀虫剂的应用，优化绿色合成流程，统一合成纳米粒子的尺寸，提高其对害虫的毒性作用，同时降低对非靶标生物的影响以及对环境的威胁，将会成为未来纳米农药领域重要的研究方向。