关节软骨损伤修复研究展望

敖英芳 代文立

关节软骨损伤是全世界性多发常见的健康问题之一。由于关节软骨缺乏血运，创伤性软骨损伤所造成的局部软骨缺损通常是由新的纤维软骨组织来进行填充。与透明软骨相比，纤维软骨机械强度明显较弱，并且会随着时间的推移而逐渐退化，导致结构和功能的丧失，并逐渐发展为骨性关节炎，最终导致进行性全关节破坏。目前临床上对于创伤性软骨损伤局部缺损尚无治愈方法，有学者建议对其进行早期外科手术，例如进行微骨折手术或自体骨软骨移植手术，以尽可能恢复关节软骨覆盖、促进愈合，最大程度地减少关节的退化[1]。通常，这些外科手术方法仅能有限地进行组织再生，短期缓解症状。近年来，新兴的组织工程技术因可以有效地促进组织修复再生而备受关注。本文中，我们对目前临床上常用的软骨损伤修复方法、处于临床前研究及基础研究的修复方法进行讨论，并展望关节软骨损伤修复的临床前景与发展方向。

一、微骨折技术

微骨折技术通过开放软骨下骨，从而在软骨缺损和下方的骨髓之间形成通道。目前，临床与研究上普遍认为，通过这些通道将多能性骨髓间充质干细胞释放募集到缺损部位以修复关节软骨。这项技术由于其简单快捷性和低成本在临床经常使用。然而，这种方法仅对小的缺损有效，修复后形成不了透明关节软骨，术后仅能提供相对的功能改善，其临床作用与意义相对有限。

二、骨软骨移植技术

自体骨软骨移植手术也应用于临床，是在关节非负重区域软骨面上取出圆柱形骨软骨组织植入到负重区软骨缺损处。尽管有文献报道通过自体骨软骨移植得到较好的临床效果，但结果会因年龄，性别和病变大小而有很大不同。同时供体部位损伤与不适以及局部供体组织的可用性有限，使得自体骨软骨移植仅适用于某些中、小尺寸的软骨缺损。同时移植骨软骨之间的软骨修复愈合，移植软骨与受区周边软骨的愈合都存在问题，另有供区损伤带来的创面开放，出血炎性因子释放等对关节内微环境、内稳态等带来的不利影响使其应用受到限制并逐渐趋少。同种异体骨软骨移植尽管没有供区损伤以及移植物大小不足的问题，但存在同种异体移植物的保存、组织的可用性、受者免疫反应等问题，同时供体来源不足以及质量等又是临床应用的实际问题。

三、自体软骨细胞移植技术(autologous chondrocyte implantation,ACI)

ACI技术能够适应软骨缺损的轮廓，使其对于治疗大面积(> 3～4 cm2)软骨损伤具有很强的临床吸引力。ACI需要进行两次手术：第一次手术时需从健康的关节非负重区软骨中取材软骨组织，在体外培养扩增软骨细胞，然后进行第二次手术将培养扩增的软骨细胞植入软骨缺损部位进行修复。这项技术的更新版是在植入前将软骨细胞播种到支架上，称为基质诱导ACI(matrix-induced ACI,MACI)。据报道，接受MACI治疗的病人膝关节功能可较长期改善，满意度也较高[2]，但是也需要体外培养扩增软骨细胞和两次手术才能完成。该方法最初在国际上临床应用研究较多，但因其局限性，目前在临床应用上也受到限制，不如仅需要一次手术的修复方法对临床医生更具吸引力。

四、自体基质诱导软骨形成技术(autologous matrix-induced chondrogenesis,AMIC)

相对于需要两次手术的ACI，AMIC可以在单次手术中完成。为了进行AMIC，手术医生需要暴露并清理缺损部位，然后做微骨折释放骨髓中的间充质干细胞(MSC)，最后将Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白混合制作的生物膜缝合或粘合到软骨缺损区。胶原蛋白基质被认为可以稳定血凝块，有助于促进早期的机械稳定和软骨再生。研究发现，AMIC在治疗全层软骨缺损方面安全有效[3]。在一项长达5年随访的研究中，进行AMIC的病人在Tegner，Lysholm，ICRS和Cincinatti评分方面均有显著改善[3]。此外，MRI显示所有软骨缺损有中度到完全填充。我们牵头进行了相关的多中心总计120例的随机对照临床研究，通过使用AMIC对软骨损伤病人进行修复，取得了很好的近期疗效。然而，由于总体研究存在病例较少，随访时间短等的问题，最终临床效果尚需更高质量的临床研究来进一步验证。

五、组织工程修复方法

1.组织工程支架：目前认为，良好的组织工程支架是可以仿生天然组织的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)功能特性，可以促进细胞的封装，并支持细胞增殖和ECM生成的生物材料。当不使用支架时，邻近正常的软骨将由于缺乏植入物而影响愈合。为此，生物材料应该由在结构和功能上与天然关节软骨相似，并且是由在生物学上相容的材料组成。为了代替天然关节软骨ECM，支架应能够：(1)产生高度水合的环境，以便交换养分，电解质，氧，代谢废物，以及影响细胞活力、分化和功能的小分子介质；(2)抵抗径向和纵向变形并吸收压缩载荷；(3)建立紧密的细胞-基质接触，以保持细胞的活力、分化能力和功能；(4)与相邻的软骨组织无缝融合，并黏附于软骨下骨。

目前已经研究了多种合成或天然材料，其中天然材料包括藻酸盐，明胶，琼脂糖，透明质酸，纤维蛋白以及胶原蛋白等。而合成材料更多样化，通常包括聚ε-己内酯，聚1-乳酸，聚乳酸-乙醇酸，聚乙烯醇，聚乙二醇，聚氨酯和自组装肽等。天然聚合物具有良好的生物可降解性以及生物相容性，但其组成因批次而异。合成材料更易于复制，其性质可以精确控制。其中，基于聚己内酯和自组装肽的支架在体外能维持软骨细胞的增殖和分化。然而，相对于合成材料，天然材料正被更多地用于临床研究中。其中，由我们团队研发的脱钙皮质骨支架已经在动物软骨缺损模型中成功实现了软骨修复，并且通过将脱钙皮质骨支架与壳聚糖水凝胶相结合，或是将其与MSC特异性亲和肽相结合[4]，均显示出了优异的软骨修复能力。而在人体内，脱钙皮质骨支架应用5～7年的随访临床效果良好。目前，该支架已实现成果转化，正在开展多中心临床研究并显现出非常好的临床应用前景。

尽管组织工程支架提供了许多优势，但使用支架还可能出现与降解相关的毒性，应力屏蔽，细胞表型改变和重塑障碍等问题，这些问题为研究无支架技术提供了动力。无支架的自组装过程能促进细胞间相互作用，囊括了软骨发育的相关条件，并可以导致硫酸软骨素6与硫酸软骨素4的比率发生变化，以及Ⅵ型胶原蛋白向Ⅱ型胶原蛋白发生转化。通过使用生物化学和生物力学刺激，使用无支架方法制造的工程软骨可以获得与天然软骨组织相当的功能特性。例如，无支架的工程软骨的压缩模量和拉伸模量可以分别达到-0.32 MPa和-8 MPa，分别在天然软骨的压缩(0.1～2.0 MPa)和拉伸(5～25 MPa)模量的范围内[5]。另外，无支架方法有可能规避与支架相关的缺点并生产具有生物力学功能的植入物。

组织工程支架的进展也集中于对天然组织结构的模拟上。例如，衍生自聚乙二醇和硫酸软骨素的刚度梯度水凝胶可以产生具有刚度依赖性糖胺聚糖梯度的结构，该结构模仿了关节软骨浅表层和深层区域之间的糖胺聚糖梯度[6]。在另一项研究中，具有多孔层的双层聚ε-己内酯支架可以促使工程软骨的带状排列的形成[7]。这些研究表明，实现软骨的各向异性特性对于组织工程软骨模拟天然软骨的功能特性是很重要的。

作为个性化医学领域的一项革命性技术，3D生物打印可以按照需求逐层沉积生物材料，从而使3D构建体适应特定病变形状。目前已经有多种不同的打印策略用于软骨组织工程：喷墨打印，激光辅助打印和生物挤出打印。喷墨生物打印是基于通过热法或压电法将液滴直接沉积到载体上的方法。激光辅助生物打印是在激光能源的影响下，将特定材料上的液滴沉积到接收载体上的方法。生物挤出打印是通过打印针直接将生物墨水沉积在载体上的技术。在这三种技术中，已经有研究者通过生物挤出技术，将天然材料(明胶，壳聚糖，藻酸盐，透明质酸)或人工合成材料(PGA，PCL，PEG)和细胞混合进行打印。由于生物挤出技术允许打印具有高细胞密度的生物支架，使其成为构建全层软骨组织的优良候选者。同时，它允许在生物墨水的不同层次中沉积不同的生物材料和细胞类型，以更好地模仿天然骨软骨组织中不同的组织层次。其中，我们团队通过3D打印技术开发出一种新型丝素蛋白-明胶复合支架，通过调节丝素蛋白和明胶的比例以平衡支架的机械性能和降解速率，并将支架与BMSC特异性亲和肽相结合。这种双重优化的支架在膝关节软骨修复中表现出卓越的修复性能，因为它不仅保留了足够的干细胞，而且还充当了血凝块的物理屏障，并在新软骨形成之前提供了机械保护。该支架已经成功在动物实验中构建出了透明软骨样组织[8]。

在使用挤出法的3D生物打印时，生物墨水的生物相容性和可打印性是两项关键的特性，而打印的稳定性和机械性能也是重要考虑因素。为了确保3D构建物的稳定，可以通过温度变化，光交联或化学交联来固化打印后的构建体。另一种打印的方法是打印异质性支架，该支架由PCL支架和包含细胞的水凝胶组成[9]。生物挤出技术的优势在于能够直接打印生物墨水和细胞，同时生产功能化的构建体。通常通过评估打印细胞的活力来评估墨水的生物相容性。在比较不同的生物墨水的可打印性时，剪切应力和黏度是重要的参考因素。剪切应力会受到不同的打印参数的影响，例如针的几何形状和直径。通常这些参数需要进行微调，以提高最终的3D构建物中的细胞活力和分化潜能。

2.种子细胞：工程软骨植入物的理想细胞来源应该是易于分离和扩增的细胞，并且可以形成并维持软骨相关表型，合成丰富的透明软骨ECM，而且不会引起免疫学反应。在这方面，来自病人的关节软骨细胞似乎是首选。在1990年代，Brittberg等从膝关节损伤病人中分离出关节软骨细胞，并将这些软骨细胞植入培养基中生长，然后将其植入病人中。但是，在关节镜下观察到其对邻近正常软骨的整合不良。与该技术相关的其他问题包括供体部位有限，体外细胞扩增的需求较高，以及修复部位移植物的过度生长[10]。

来自不同来源的MSC，例如骨髓，脂肪组织，滑膜，脐带血，外周血等，被用于治疗关节软骨缺损。这些细胞具有易获得性、良好的分化和增殖潜力、以及抗炎和免疫调节特性。不同来源的MSC分化成软骨细胞的能力各不相同，其中滑膜来源的MSC表现出最大的分化成关节软骨细胞的潜力[11]。但是，MSC的移植可能会产生软骨和纤维组织的混合物，并且从长远来看这可能会导致修复的失败。因此，在将MSC成功用于软骨修复之前，需要进一步研究其分化的方案。

胚胎干细胞(ESC)具有增殖和分化成几乎任何类型的体细胞的潜力。将ESC转化为软骨细胞的各种方法包括与软骨细胞共培养，以及先从ESC产生类似于MSC的细胞，然后利用多种生长因子将其分化为软骨细胞。利用ESC进行软骨再生的缺点包括伦理学上的担忧，即人类胚胎的破坏，宿主的免疫排斥，以及畸胎瘤形成的风险。

诱导多能干细胞(iPSC)代表了一种相对较新的干细胞来源，具有与ESC相似的自我更新和多能能力，但没有相关的道德和免疫原性问题。从人iPSC(hiPSC)生成软骨细胞的策略目前正在开发和完善中。在目前应用于iPSC的各种诱导软骨分化的方法中，最有前途的是模仿自然发展，将iPSC的单层培养首先分化为中胚层，然后进一步分化为软骨培养[12]。然而，尽管hiPSCs在临床上首次用于治疗黄斑变性已引起关注，但当使用其用于软骨分化时，新形成的软骨的纯度和均质性仍然存在差异，并且来自hiPSCs的软骨细胞的体内移植仍然会有肿瘤形成的风险。

3.生物力学及生物化学刺激：研究表明，生物力学刺激对于软骨稳态的维持具有重要作用。目前生物力学已经用于改善工程软骨的性能。与未受刺激的新生软骨相比，将轴向压缩应用于软骨细胞以后可以使其瞬时模量提高92%[13]。另外，也有研究发现，张力也具有改善新生软骨生物力学特性的作用。用张力刺激，软骨素酶ABC，TGFβ1和LOXL2同时处理自组装软骨后，其拉伸模量和强度可以提高大约6倍[14]。通过压缩和剪切应力相结合，可以导致软骨细胞产生的Ⅱ型胶原蛋白明显增加[15]。同时研究也表明，机械应力可以影响软骨的分解代谢和合成代谢，新合成的基质会因为机械应力而产生结构的重塑[16]。承受循环单向压缩载荷的软骨组织可以瞬时增加MMP-3和MMP-13的表达，并在刺激后2小时出现分解代谢变化，其特征是蛋白聚糖和胶原蛋白释放到了培养基中。但是刺激12小时后，会出现合成代谢变化，具体表现为Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖表达增加，提示循环负荷具有重塑软骨的作用[17]。这些研究的结果表明，生物力学刺激在工程化软骨组织的形成中具有重要作用。了解软骨在天然条件下的生物力学环境，以及其对体内和体外软骨组织的影响，对于实现工程软骨的临床转化非常重要。

在众多生物化学刺激因子中，生长因子一直被认为是软骨形成的重要调节因素。已经证明，TGF-β家族的成员在软骨发育中起重要作用。它们通常被用于诱导MSC向软骨细胞分化，增加软骨ECM的合成，以及增强软骨细胞的增殖。多项研究表明，TGF-β亚型在各种细胞类型上的作用不同，其中TGF-β1负责介导MSC之间的相互作用，TGF-β2介导MSC的肥大性分化，而TGF-β3具有较强的促进MSC分化的作用。另一个生长因子IGF-1以合成代谢的方式起作用，并可以增加蛋白聚糖和II型胶原的合成。FGF-2是一种参与伤口愈合的促细胞分裂因子，已被用于维持软骨细胞的表型，增加软骨细胞增殖以及软骨的ECM沉积。BMPs影响软骨形成和成骨，因为它们可以协助植入部位的骨软骨整合，因此对于修复骨软骨缺损具有吸引力。其中，BMP-2可以增加TIMP-1，Sox 9，Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的表达，而BMP-7可以刺激富含蛋白多糖的ECM的产生。此外，BMP-2和BMP-7在ECM产生方面具有协同作用。除了上述多种生长因子外，研究人员也研发了多种小分子药物以促进骨软骨修复，例如kartogenin(KGN),aptamer,Y-27632等[18]。其中由我们团队开发出可特异性募集软骨细胞归巢的多肽(CAP,DWRVIIPPRPSA)，以及促进MSC归巢的多肽(E7、L7)，通过将其与脱钙皮质骨、丝素蛋白等天然支架相结合，可以显著增加软骨损伤处相应细胞的募集，并在软骨再生修复中表现出了明显的促进作用[19]。除了我们团队以外，已经有其他研究团队成功使用了E7结合外泌体来促进关节腔内的滑液MSC向软骨细胞分化[20]。

近年来，外泌体在骨性关节炎发展中的重要性已逐渐受到关注，而其在软骨修复和骨性关节炎治疗中的价值也逐渐被揭示。作为是MSC的关键分泌产物之一，外泌体可以产生类似于亲代MSC的作用，并已经用作各种疾病模型的治疗剂。近年来，已经有大量研究报道来自不同类型MSC的外泌体可以对软骨损伤产生确切的治疗作用。另外，Liu等[21]通过qRT-PCR分析证实了MSC和MSC外泌体中的lncRNA KLF3-AS1可能是具有治疗作用的关键分子。在他们的研究中，用敲低lncRNA KLF3-AS1表达的外泌体处理大鼠软骨细胞可以逆转外泌体对软骨保护作用，同时，没有lncRNA KLF3-AS1表达的外泌体也可以加剧大鼠膝关节的软骨损伤。这些数据表明，外泌体对骨性关节炎的治疗作用可能与lncRNA KLF3-AS1有关。有趣的是，水凝胶材料已被证明具有良好的外泌体保留和持续释放的功能。Schneider等[22]发现封装在PEG水凝胶中的软骨细胞可以分泌许多存在于外泌体中的蛋白质，他们认为，较小的外泌体在水凝胶中具有更好的扩散能力。Liu等[23]利用光诱导的亚胺交联水凝胶作为外泌体支架来制备用于软骨再生的脱细胞组织片，他们发现，大多数封装的外泌体在PBS中浸泡14天后仍然保留在水凝胶内部。由于不同MSC来源的外泌体成分有所差异，在进行软骨修复时，选择何种MSC来源的外泌体仍存在争议。基于此，我们团队通过对比骨髓、滑膜、以及脂肪MSC来源的外泌体，发现脂肪MSC来源的外泌体在体外可以更好地刺激BMSC的迁移，增殖，软骨形成和成骨分化，并且可以在小鼠模型中更好地促进软骨和骨的再生[24]。

六、总结与展望

由于关节软骨缺乏自我修复能力，关节软骨损伤是目前临床上最具挑战性的关节伤病之一。目前，外科修复技术尚难以阻止其骨关节炎的发生与进展，从而加速了组织工程与生物治疗技术的发展。在过去的二十年中，已经研用了许多不同类型的用于软骨组织工程的生物支架。这些支架与不同来源的细胞相互组合，以促进损伤修复区新的软骨组织再生。尽管研究者做出了巨大的努力，致力于制造模仿ECM的支架，并且在细胞培养后提供了模拟天然软骨的生物力学、生物化学刺激，但到目前为止，这些方法中只有很少数达到了临床试验阶段。主要挑战在于制造合适的支架，这些支架能够在植入后承受施加于负重关节的负荷，在降解后可以形成连贯成熟的新生软骨，并能与周边天然软骨进行良好的整合。合适的种子细胞来源尚待确定，尽管直接使用软骨细胞似乎是解决方案，但在大多数情况下，软骨细胞在增殖时去分化是不可避免的。由于具有高生存力，招募手术的侵入性较小，以及较高的分化潜力，干细胞成为最常见的种子细胞来源。同时，将关节腔整体作为生物反应发生器和再生组织培育的微环境，通过骨髓刺激技术释放自体干细胞，利用脱细胞基质或生物3D打印获得的良好仿生生物膜修复软骨损伤区域的自体、原位、一次手术修复技术更具有良好的研究与临床应用前景。此外，带有活细胞的生物 3D打印技术应用到临床手术台上直接修复关节软骨损伤更为人们所期待。