组织工程技术促进骨腱界面有序再生的应用展望

刘俊 赵鑫 陈贝 石新 李煕莹 曹焱鹏 陈耀武 吕红斌

骨腱界面(bone-tendon interface,BTI)是存在于肌腱和骨之间的锚定结构，根据其组成结构的不同可分为纤维性BTI和纤维软骨性BTI。纤维软骨性骨腱界面包括肌腱、未钙化的纤维软骨、钙化的纤维软骨及骨这四层相互延续的结构。骨腱界面的组织成分、细胞排列和力学性能具有梯度渐变的特点，有利于应力在软硬界面(肌腱和骨)之间的传导[1]。相对于骨和肌腱的愈合，骨腱界面的损伤修复更加缓慢，组织学染色发现骨腱损伤处的基质成分和组织结构紊乱，且常伴有瘢痕组织增生[2]。损伤的骨腱界面无法快速完全地恢复至损伤前的正常层次结构，其生物力学性能较差，这将直接影响病人运动功能的恢复[1]。因此，如何促进骨腱界面损伤后快速而优质的愈合及其功能的恢复是运动医学领域亟待解决的难题。

一、骨腱界面组织结构和成分的梯度渐变特征

骨腱界面的功能取决于其结构的完整性，大量的研究从宏观和微观角度对骨腱界面的力学环境进行了解析：肌腱纤维、细胞排列、矿化分布、基质成分等骨腱界面组织在应力传导方向上呈现出梯度演变的结构特点，这一结构特征有利于提高应力在软、硬界面中的传导效率[1,3]。利用同步辐射技术对骨腱界面的化学成分进行解析发现，在骨腱界面纤维软骨层中富含蛋白多糖以及钙、锌等微量元素，这些基质成分的含量及分布也同样呈现出梯度渐变的特点[4]。

有研究证实，损伤状态下梯度渐变的组织结构的破坏是骨腱界面损伤的主要组织病理特征。在骨腱界面损伤修复的过程中，瘢痕组织占据了大量的组织再生空间，原来的四层结构难以有序恢复至损伤前水平[2]。另外，损伤后的骨腱界面中各种胶原、蛋白成分及金属元素都有不同程度的丢失，并且在损伤区域内排列紊乱、极性缺失，应力的传导方向也各不相同[2,5]。

二、实现骨腱界面损伤有序再生的新要求

骨腱界面的组织结构包括力学性能完全不同的生物组织：肌腱、软骨和骨，当外界应力施加于以上具有不同力学性能的组织时，它们将出现不均匀的形变，这会引起界面处的应力集中，进而增加骨腱连接部位撕裂或术后再撕裂的风险[1]。实现骨腱界面有序再生的重点即在于促进骨腱界面中骨、软骨、肌腱的再生，在2017年美国国立卫生院举办的肌腱韧带专题会议上，领域权威着重讨论了骨腱界面损伤修复的新策略，明确指出实现骨腱界面损伤后的原位修复极具挑战，促进骨腱界面损伤区域的骨、软骨、肌腱的有序再生是治疗骨腱相关疾病的重要出路[5]。目前的观点认为，激发损伤区骨、软骨、肌腱的修复潜能，恢复损伤区域骨腱界面原有的组织结构和基质成分的梯度渐变特征，是重建骨腱功能的最理想方案[6]。

三、组织工程技术促进骨腱界面有序再生的应用策略

组织工程技术在骨腱界面的研究中的应用前景广阔。鉴于恢复梯度渐变的组织结构是促进骨腱界面有序再生的重要目标，目前的组织工程实践侧重于模拟天然骨腱界面的微观结构以及复杂的细胞及其生存微环境[7]。我们可以针对材料进行优化设计和修饰，来部分实现正常骨腱界面梯度结构的仿生。此外，再生微环境中内源性干细胞方面的最新研究进展也给我们设计骨腱界面损伤后组织的原位有序再生策略提供了新的种子细胞来源[5]。

为了实现骨腱界面中骨、软骨和肌腱的有序再生的目标，我们应该更加地关注支架材料、种子细胞和细胞因子三者的协同作用，其远期的应用发展主要集中于：材料的仿生设计、种子细胞优化和生长因子控释这三个方向[7]。

1.支架材料的仿生设计:支架的构建一直是广大学者们关注的重点。一方面，我们需要材料来模拟正常骨腱界面的结构特征，实现形态和力学性能的梯度渐变仿生。另一方面，支架材料应具有良好的生物相容性，尤其应该具备优越的性能-细胞交互性，能够促进内源性修复细胞定向分化并分泌特定的细胞外基质，从而形成梯度渐变的组织结构，实现骨腱界面的原位再生[6]。

利用去细胞技术制备的生物衍生支架材料具有组织天然相容、结构自然仿生的优势。这类材料由于去除了组织内的细胞和抗原物质，因此避免了免疫排斥风险。同时，这类材料往往保留了与正常组织相似的组织成分和形态结构，能够最大限度地保留原组织的力学性能[8]。在组织工程去细胞支架的研究中，学者们遇到诸多问题，他们往往在减少试剂残留、基质成分保留和提高脱细胞效率等问题之间难以取舍。学者们采用物理方法对组织块进行切割、打孔，试图在利于细胞迁入、保留力学性能和提高去细胞效率之间找到平衡点[8-9]。一方面，类似“书页”状组织薄片切割通过增加去细胞液与组织的接触面积，能够显著缩短组织去细胞的处理时间，避免细胞外基质成份的大量流失，并且能够最大限度地保留原组织的力学性能。另一方面，薄片支架之间的固有物理间隙给干细胞的迁入提供了空间，这无疑有利于支架的再生命化和组织原位修复再生[10-11]。

针对单纯去细胞支架中细胞成分丢失、难以再生命化的难点，采用去细胞支架材料负载具有修复效应的干细胞往往能够重新赋予组织工程支架生物活性[12]。学者们通过制备一种形态结构仿生、成软骨诱导性能优良的去细胞纤维软骨书页支架，并与宿主的自体脂肪间充质干细胞片合体组装，最终制备成具有自主生命力的组织工程纤维软骨移植物，该移植物能够显著促进纤维软骨再生[13]。为了提高去细胞生物支架的仿生性能，学者们将获取的骨、纤维软骨和肌腱组织分别制成易于吸收的薄片书页状支架后，进行去细胞处理，并根据天然骨腱界面梯度渐变的结构和成分特征，将去细胞骨、软骨、肌腱这3种支架进行堆叠组装，从而构建结构与成分仿生的去细胞三相书页支架[14]。相比于单一组织来源的支架骨腱界面移植物，三相支架能够更好地模拟骨腱界面的梯度渐变特性。

在人工材料领域，学者们利用高分子材料作为首选的支架材料。目前多采用磷酸三钙、羟基磷灰石和生物活性玻璃等材料。这些材料在体内降解缓慢、重复性好，具有易于调节、易于修饰的特点。能够精确地控制材料的硬度、制备工艺及表面拓扑结构等特性，这使设计的支架能够较好地模拟出正常骨腱界面的形态特征[7]。随着一些具有良好的生物相容性和亲和性的材料的出现，新近设计的组织工程支架更易于局部细胞的附着，并且能够创造一个适合细胞增殖和分化的环境[7,15]。已有学者利用生物相容性较好的多聚物，制备了力学仿生的组织工程支架和补片以促进肌腱以及纤维软骨层的再生，从而治疗骨腱损伤性疾病[7]。针对单一材料的组织工程移植物难以在一个支架上实现差异化设计及仿生骨腱界面梯度结构设计的难题，分层仿生设计的高分子材料支架应运而生[15]。这种组织工程支架旨在模拟正常骨腱界面的渐变结构，从而重建骨腱界面的生物学功能。通过在体外制备了异质性的多层结构支架，来模拟天然骨腱界面结构和力学性能，且在不同区域诱导干细胞成骨、成肌腱分子特异性表达，旨在促进骨腱界面中骨、软骨和肌腱的有序愈合。

2.种子细胞优化:具有修复能力的细胞在界面组织中的再生、组成和稳态中起着“原动力”的作用。一般来说，种子细胞可以分为两种不同类型的细胞：功能细胞，如成纤维细胞，软骨细胞和成骨细胞；未分化细胞，如间充质干细胞(MSCs)和组织特异性干细胞[7]。

功能细胞是不具备增殖能力的成熟体细胞，常选择目标组织中的主要细胞成分来用作种子细胞。应用功能细胞能够直接补充损伤区域丢失的组织细胞或者替代损伤后功能失调的残留细胞。相较于难以确定最终分化方向的干细胞，功能细胞的生命路线通常更加确切可控。目前，已有大量研究采用软骨细胞、肌腱细胞等应用于诸如软骨缺损、肌腱损伤等运动系统损伤的治疗[16]。

间充质干细胞是组织工程未分化细胞的理想选择。它们来源于发育早期的中胚层，在成年个体的骨髓、脂肪等组织中保持静息状态，其增殖能力强、免疫原性低、多向分化潜能好，可在体内分化成包括骨、软骨、肌肉、韧带等多种类型的组织[6,17]。学者最早将骨髓间充质干细胞种植在腘绳肌腱移植物的表面，结果显示复合干细胞的移植物能够更快地与骨隧道愈合，在术后2周就形成非常明显的纤维软骨层[18]。其他诸如脂肪间充质干细胞、尿源性干细胞也被发现具有自我更新与多方向分化潜能，同时具备数量多、易于获取的特点，已有研究证实它们在骨腱界面损伤修复中起到积极的作用[16]。

也有学者尝试在肌腱组织中寻找具有增殖分化能力的内源性干细胞，并用来治疗肌腱损伤。现有的观点认为骨、肌腱组织特异分布的干细胞能够更好地适应组织原位的微环境，在植入后能够保持较高的活性[17]。学者们收集前交叉韧带来源的CD34阳性细胞，制备成富含种子细胞及相应细胞外基质的干细胞片，将干细胞片包裹在肌腱移植物的表面并植入前交叉韧带重建的骨隧道内来促进骨腱界面的愈合[18]。

为了规避术后炎症反应对外源性干细胞的损耗，学者们选择在宿主的炎症反应消退后，将干细胞注射到骨腱所在的关节内，通过缓释具有趋化作用的生长因子来募集外源性干细胞到达骨腱界面的损伤局部，并参与其修复过程。此方案简化了支架在体外负载细胞的步骤，一定程度上保障了植入细胞的存活率，并且有效地规避了术后早期炎性反应对外源性干细胞的损耗，这为开发骨腱界面组织工程治疗方案提供了一种新模式，有利于进一步在临床推广应用[19]。

3.细胞因子控释:探索不同生长因子组合和输送模式对骨腱愈合的影响是界面组织工程在未来几年将面临的挑战之一。研究表明，生长因子在骨腱界面的组织发育、稳态保持和损伤修复过程中发挥着重要作用，根据生理效应的不同主要分为分化诱导因子、血管生成因子、趋化因子等。不同的细胞因子对骨、软骨、肌腱等多相组织的修复发挥着迥然不同的作用。研究表明，2型骨形成蛋白(BMP-2)、转化生长因子(TGF-β)等能够分别通过诱导组织成骨、成软骨分化，血管内皮生长因子(VEGF)能够诱导血管形成，基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)能够募集干细胞至损伤区域[7,20]。骨腱界面结构的梯度渐变特征给细胞因子在局部的应用提出了更高的要求，要恢复损伤后骨腱界面的功能，就需要再生组织中的骨、软骨、肌腱细胞，并合成、重塑相应的细胞外基质[6,20]。鉴于此，在骨腱界面中采用细胞因子策略需要重点关注成骨分化、成软骨和成肌腱分化诱导因子的应用。

另外，严格控制生长因子的作用位置和浓度对于刺激特定细胞分化的行为至关重要。某些生物因子与支架负载不强，在植入体内后会以瀑布式释放的模式大量分布在移植物周围，局部高浓度的生物因子有引起细胞凋亡、异常分化的风险[7]。而当大量早期释放的生物因子被灭活后，后续从支架中释放的残留细胞因子不足以发挥足够的生物效应。为了规避上述生物因子应用的不足，学者们通过修饰支架材料、修饰生物因子、制备缓释微球等方式来实现生物因子在材料上的附着和缓慢释放[20]。

为了提高细胞因子在支架材料上的缓释效果，学者们另辟蹊径，他们合成并纯化了具有胶原结合特性的基质衍生蛋白1α(C-SDF-1α)，并证实具有胶原结合特性的SDF-1α有着与正常SDF-1α(N-SDF-1α)相当的干细胞募集效能，C-SDF-1α可特异性地结合在去细胞纤维软骨书页支架上的胶原成分，从而实现生物因子在支架上的缓慢释放。

四、展望

随着材料科学和医学的不断发展，组织工程的理论和技术在骨腱界面中的应用已达到前所未有的高度。学者们在探寻新材料、新工艺的同时，更加关注材料和移植微环境之间的相互作用，旨在让设计的移植物更加的“智能化”、“功能化”，更加关注并把握移植的材料和细胞在宿主体内经历的生命过程。学者们从结构、成分、力学特性的角度出发，使组织工程支架更加贴近天然组织，以提供更加合适的细胞微环境。同时，组织特异性干祖细胞的发现给骨腱界面的研究带来更多可能性，在骨腱界面中存在着特异性干细胞，利用这些内源性干细胞能够更加高效地促进骨腱界面的损伤修复，这也是未来研究的方向之一。有一点我们可以确定的是，制备更高程度仿生的组织工程移植物是实现骨腱界面有序再生的重要手段。同时多学科的交叉整合同样也是组织工程发展的必要途径，相信通过实现对天然骨腱界面结构和成分的高度模拟，实现骨腱界面损伤后的原位有序再生将不再是镜中之花，水中之月。