纤维软骨透明化的研究进展

史冬泉 李嘉威

软骨是人体中必不可少的组织，分布在人体的四肢关节，椎间盘，支气管和外耳轮廓等。四肢关节处的软骨组织为透明软骨，主要起着承重和抗磨损的作用。膝关节、髋关节等承重关节的透明软骨在骨关节炎(osteoarthritis,OA)中产生磨损和退变是其主要致病因素之一。软骨组织中因为缺乏血管，神经和淋巴组织，其自身修复能力十分有限。一项针对OA软骨细胞的单细胞转录组学分析发现，在OA进展的晚期阶段，关节中的透明软骨在经历炎症和磨损后逐渐被纤维软骨所取代[1]。传统的软骨修复技术，包括自体软骨细胞植入和微骨折无法复制出天然软骨组织的生物力学特性[2]。有研究报道在自体软骨细胞植入后，关节中的生物力学环境和化学环境会导致软骨细胞呈成纤维细胞表型，导致90%以上的新生修复组织为纤维软骨[3]。正常的软骨能够承受的力高达体重的6倍[4]。承重时，透明软骨的细胞外基质内部的静电和空间相互作用阻止了水分流失并承担了大部分负载。但是，纤维软骨无法实现这种结构-功能关系[5]。所以纤维软骨在承重和抗机械磨损方面的能力远不如透明软骨，关节中纤维软骨会导致OA病情的进一步恶化[6]。近年来发展迅速的软骨组织工程虽然为透明软骨的生成提供了很多的选择[7]，但纤维软骨始终被作为摒弃的对象，没有加以利用和开发。因此，OA和软骨损伤后所产生的纤维软骨是不可忽视的存在且必须考虑软骨损伤修复治疗原则中。阻止透明软骨纤维化和促进纤维软骨透明化有效利用原位纤维软骨改性，将作为研究开发的重点。本文将从纤维软骨产生的病理机制出发，讨论透明软骨和纤维软骨的差别，并进一步探索针对纤维软骨的治疗策略，提出"纤维软骨透明化"的治疗原则，展望纤维软骨透明化的可行性。纤维软骨透明化的关键是利用病变或周围区域的细胞外基质(包括胶原蛋白和糖蛋白)，以及动员或修饰邻近的组织和细胞(纤维软骨细胞和透明软骨细胞)以实现转化。

一、关节软骨纤维化是纤维软骨产生的主要原因

组织损伤的修复过程包括细胞增殖，细胞分化以及细胞外基质的合成和重塑。但是异常的修复过程会导致组织中细胞外基质蛋白的过度分泌和沉积，继而引起过度的纤维化，最终导致瘢痕形成甚至组织破坏[8]。虽然在其他类型的软骨组织(如半月板或椎间盘)中可以发现纤维软骨的存在，但在关节软骨中它的出现却提示着软骨组织的退变损伤。OA过程或软骨损伤修复中形成的纤维软骨就是关节软骨过度纤维化的结果。在病理条件下，软骨细胞的合成分解代谢的紊乱会导致软骨损伤和退变。因此原本处于静止状态的透明软骨细胞开始活跃增生，并在软骨病变区域中形成细胞簇，以适应软骨微环境的变化[9]。活跃增殖的软骨细胞开始转变或去分化为具备成纤维细胞表型的细胞。其细胞形状，代谢方式和细胞骨架结构发生急剧变化，最终导致Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)合成的增加，该胶原蛋白通过形成无机械能力的纤维软骨样组织而削弱了软骨组织的生物功能[10]。在正常的关节透明软骨中，Ⅰ型胶原蛋白仅占总体积的1.7%，而Ⅱ型胶原蛋白占近100%。Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ)表达的减少和Ⅰ型胶原蛋白表达的增加是关节软骨细胞去分化和纤维化的主要特征。软骨细胞和周围环境的这些变化最终导致异常的软骨细胞增殖和肥大分化，最终引起软骨细胞凋亡。

二、透明软骨与纤维软骨

透明软骨是最常见的软骨类型，在发育过程中可作为胚胎的临时骨架直到逐渐被骨组织替代为止。透明软骨的基质由丰富的糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)和高度黏附的胶原纤维组成[11]，其软骨细胞的形态主要为圆形。透明软骨的主要胶原蛋白类型是Ⅱ型胶原蛋白(> 90%)，但是Ⅲ型胶原蛋白(0～10%)，Ⅸ型胶原蛋白(1%)，Ⅺ型胶原蛋白(3%)，Ⅵ型胶原蛋白在调节软骨细胞机械转导中起着重要作用。Ⅱ型胶原蛋白是透明软骨细胞外基质的主要固体成分，可通过限制带负电荷的GAGs施加的溶胀压力来提供组织的整体形状。在OA或软骨损伤过程中，形成的最常见的非透明软骨组织是机械性较差、富含Ⅰ/ Ⅱ型胶原蛋白的纤维软骨。但是目前对于纤维软骨仍然缺乏一个精准的定义，因此纤维软骨组织学和免疫组织化学特征成为鉴定的基础。有研究报道，纤维软骨是一种介于透明软骨与密集规则的结缔组织(如肌腱和韧带)之间的过渡组织[12]。Ⅰ型胶原蛋白的增加使得软骨的细胞外基质的排列变得更加致密，软骨细胞呈现如成纤维细胞样的梭形状态，因此无法实现透明软骨原有的承重和抗磨损的生物功能。相对于透明软骨细胞，纤维软骨细胞最重要的特征就是产生成纤维细胞的表型，比如包含α-SMA(α-smooth muscle actin),一种纤维细胞所含有的细胞骨架蛋白。因此纤维软骨细胞表型的特征可以概括为以下几点:(1)同时表达软骨细胞表型蛋白(SOX9,Col Ⅱ)和纤维细胞表型蛋白(α-SMA,Col Ⅰ);(2) Ⅱ型胶原和Ⅰ型胶原的蛋白表达或者mRNA表达水平的比例约为0.2～1[12];(3) 间充质干细胞(mesenchymal stromal stem cells,MSCs)和造血干细胞的表面标志物(CD106,CD146,ITGA11,CD34,CD45,CD133) 处于低表达水平[1]。

纤维软骨的形成以及透明软骨细胞的纤维化涉及到许多复杂的生物过程和信号通路。其中最为关键的两个细胞因子是转化组织生长因子-β(transform growth factor-β，TGFβ)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)。TGFβ-SMAD2/3信号通路在透明软骨形成的生物过程中扮演重要角色，能够促进SOX9转录因子和Ⅱ型胶原蛋白的表达，加强成软骨分化和维持软骨表型。但是CTGF的表达同样也受TGFβ表达介导，其能够促进Ⅰ型胶原表达并在组织纤维化的过程中起关键作用。同时过度表达的TGFβ将会激活SMAD1/5/8通路以加强软骨肥大化过程。因此，功能紊乱的TGFβ信号通路和CTGF诱导的纤维化作用是软骨细胞表型发生改变的关键因素。同样，软骨细胞外基质中的几种成分也会影响软骨细胞的表型和行为，例如富含亮氨酸的小蛋白聚糖(small leucin-rich proteoglycans,SLRPs)[13]，腱生蛋白C(tenascin-C)[14]，层黏连蛋白(Laminin)和软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)[15]。此外，细胞外基质或关节软骨的微环境也会影响损伤或退变期间的软骨细胞，包括炎症因子水平，基质降解酶的活性和组织中的氧含量。对于软骨细胞纤维化过程的认识以及透明软骨和纤维软骨区别的理解是开展纤维软骨透明化策略最重要的基础。

三、纤维软骨透明化的展望

近年来对于软骨组织和细胞的生理病理学的深入理解推动了软骨损伤修复中透明软骨形成的研究。然而，纤维软骨是在OA和软骨损伤中不可避免形成的副产物。考虑到纤维软骨是导致关节功能进一步恶化的主要因素之一，因此本文认为将纤维软骨原位改造或修饰为透明软骨，即“纤维软骨透明化”作为软骨损伤修复治疗的重要原则之一是十分必要的。损伤或病变区域软骨的细胞外环境的改性或修饰以及纤维软骨细胞自身转化，是纤维软骨原位改造的两个重要出发点。此外，加强透明软骨表型和抑制纤维化作用是拟开展纤维软骨透明化的两个重要方向。

四、原位纤维软骨细胞改性促进纤维软骨透明化

软骨组织是人体重要的承重组织，因此软骨细胞内的细胞骨架在感知细胞外基质的机械信号以及转为生物信号的过程中扮演重要角色。细胞骨架网络是一种高度组织化的结构，可调节许多不同的细胞生物过程，包括改变细胞形状，细胞器运动，细胞迁移，内吞作用，分泌，细胞分裂和细胞外基质形成。有研究报道，细胞骨架的分布和排列以及细胞的基本结构可以通过调节细胞黏附性来影响软骨细胞的代谢和分化[16]。细胞松弛素D(cytochalasin D) 能够通过抑制软骨细胞微丝蛋白(actin)的聚合来促进软骨相关蛋白的表达来维持软骨功能[17]。此外，维持中间丝蛋白(vimentin intermediate filament)网络结构的完整性有利于软骨表型的维持，其结构的紊乱或破坏会导致关节软骨的退变，OA病情的进展以及关节功能的恶化[18]。细胞骨架重塑会影响软骨细胞蛋白质的合成和分泌，进而决定细胞的行为和功能，再而确定软骨细胞分化的方向。尽管细胞骨架重塑具有一定成软骨作用，但是是否可以从细胞自身内部转化的角度将退变的纤维软骨细胞恢复为透明软骨细胞仍需进一步研究。

各类生长因子，包括CTGF、TGFβ和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)在由于其强大的增殖潜力以及在合成分解代谢上的影响能力，在软骨修复中得到广泛研究。CTGF是CCN家族的重要成员。有研究报道，使用CTGF和TGFβ同时诱导间充质干细胞可使其分化为α-SMA阳性的纤维细胞以用于结缔组织的修复[19]。在FGF家族中，FGF18与软骨细胞的FGFR3特异性相互作用，参与软骨生成和骨骼发育，改善健康软骨细胞的增殖和细胞外基质的产生[20]。IGF-1是软骨的主要合成代谢因子，并且在软骨稳态维持，平衡蛋白聚糖合成和软骨细胞分解中起关键作用[21]。因此，在纤维软骨细胞中通过生物学手段调控各类生长因子的水平和活性来进行纤维软骨透明化具有一定可行性。

五、原位纤维软骨细胞外环境修饰促进纤维软骨透明化

细胞外环境的组成环境包括细胞外基质，细胞外氧含量，细胞外离子水平(渗透压)以及炎症因子和基质降解酶等。这些因素都能够成为促进纤维软骨透明化策略的研究对象。胶原蛋白是软骨细胞外基质最主要的成分，并在维持软骨组织的结构和形态以及生物功能中起重要作用。Ⅱ型胶原蛋白的含量决定了透明软骨的质量和组织的功能。据报道，除了构成组织的结构外，额外的Ⅱ型胶原蛋白补充还可以通过增加GAG和Ⅱ型胶原蛋白的表达而加强软骨细胞的成软骨能力[22]。外源补充Ⅱ型胶原蛋白具有两个优势，即通过填充原始的细胞外基质来改善局部软骨组织的Ⅱ/Ⅰ型胶原的比例以及增强原位纤维化组织中细胞的成软骨能力。另外，在OA发展或软骨损伤期间，软骨下骨内的细胞血管生成因子表达升高，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血小板来源的生长因子B(platelet-derived growth factor subunit B，PDGFB)，以增加软骨下骨内的血管密度。此外，病理原因导致的新生血管形成导致软骨内氧含量水平上调，从而破坏了软骨区域内原本低氧性环境。有研究验证缺氧作用能够增强Ⅱ型胶原和蛋白聚糖(aggrecan，ACAN)的表达并降低I型和X型胶原的水平[23]。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors,HIF)是一类重要的转录激活因子，可调节细胞对缺氧的病理生理反应。由于软骨细胞在生理条件下适应低氧环境，因此软骨细胞中HIF-1α的表达活跃可能是对软骨缺氧低氧环境中生存的主要适应方法。此外，HIF-1α在早期骨骼生成过程中缺氧环境中能够显著促进软骨前细胞中SOX9的表达和软骨形成[24]。因此，缺氧或HIF-1α在纤维软骨细胞中的作用以及针对纤维软骨透明化的可行性有待进一步研究。软骨细胞外基质的渗透压大约为350～450 mOsm，主要由局部的多糖浓度和离子水平决定。细胞外基质中GAG的侧链富含负电荷，因此会吸引关节液中大量阳离子，包括Na+，K+,Ca2+等。软骨细胞外基质特殊的离子环境为其提供了一个高渗环境。类风湿性关节炎或OA发生时，关节腔内的滑液的渗透压会下降四分之一左右，从而进一步引起关节软骨和关节内组织的细胞生物表型的改变。我们有理由相信，关节内渗透压的调节将会是在纤维软骨透明化策略中可行且有效的手段。

六、软骨组织工程在纤维软骨透明化中的作用

软骨组织工程是运用于软骨修复的一项结合生物学和工程学等多学科的策略。软骨组织工程在OA治疗以及软骨修复的基础实验研究和动物实验中取得巨大进展。可注射型水凝胶(hydrogel)不仅可以提供类似于透明软骨细胞外基质的生物相容性以及高度水合的3D结构，并且还能够通过其本身的黏弹性特性来改善营养物质和生长因子的输出，甚至可以包载具有干性的细胞来更有效地进行细胞移植和传递生物活性分子[25]。可注射型水凝胶为软骨再生提供了有希望的方向，但是在考虑纤维软骨透明化时，生物材料的设计要结合纤维软骨原位改造的原则并且需要探索更多手段以保证更加有效地实施。

七、总结

纤维软骨透明化是符合临床实际情况和软骨病理生理情况的软骨修复策略。然而，纤维软骨透明化的研究还面临着一些挑战。首先，很难获得用于体外实验的表型稳定的纤维软骨细胞。其次，将在组织上已经形成的纤维软骨逆转为透明软骨并恢复为原始的细胞外基质结构是相当困难的。第三，需要更加合理且智能的生物材料来辅助完成纤维软骨透明化策略。为了避免对健康组织的影响，能够智能且特异地靶向治疗纤维软骨的生物材料是必不可少的。此外，药物和生物活性因子如何向致密纤维基质里渗透也是研究方向之一。纤维软骨透明化是一个新的概念和研究方向，目前还没有证据明确的研究结果以及逻辑清晰的研究方案，所以这需要众多软骨修复研究者共同努力去解决这一令人困扰的问题。我们相信纤维软骨透明化是软骨修复的最有希望和潜力的治疗原则和策略。