内生大豆间座壳Diaporthe sojae的子囊壳促生培养及鉴定

豆明珠,蒲顺昌,闫淑珍,陈双林

(南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210023)

Diaporthe在世界范围内分布,其生活方式包括内生菌、腐生菌和病原菌[1].Diaporthe由Nitschke[2]引入,是间座壳科Diaporthacea的模式属,该属以Diaportheeres为模式种. 目前的国际藻类、真菌和植物的命名规则(ICN)要求对多型性真菌使用单一名称[3]. Rossman等[4]基于命名优先原则决定使用该属较早的有性型名称Diaporthe来代替其无性型名称Phomopsis,解决该属的命名问题.Diaporthe包括有性型和无性型两种状态,有物种名记录的Diaporthe为1 072个,Phomposis为989个(Index Fungorum 2019),但目前未能完全对其无性型和有性型的物种完成一一对应. Gomes等[5]详细描述了Diaporthe中的54个物种,包括它们的的形态和分子序列信息. Dissanayake等[6]重点研究了目前已知的171种通过培养或直接测序它们的主模式标本、附加模式标本、等模式标本或新模式标本进行识别的相关的物种. 目前迫切需要重新制定Diaporthe的物种划分[7].间座壳属的形态学特征主要包括两部分[8].间座壳属Diaporthe的形态分类存在着物种界限模糊的问题[9],尤其是子囊壳大小、子囊的大小和子囊孢子的大小等,在相近物种之间经常存在交叉,迫切需要重新制订间座壳属Diaporthe物种划分的形态学标准[7],因此,子囊壳、子囊和子囊孢子的成熟度对于间座壳属真菌的准确鉴定至关重要.

Guarnaccia等[1]采用在WA培养基上放置无菌松针对分离自欧洲葡萄的间座壳属Diaporthe真菌进行产孢诱导,从而获得了成熟的子囊壳,实现了准确的物种鉴定和描述. 李会平等在WA培养基上放置大豆茎秆诱导了所培养的Diaporthephaseolorumvar.caulivora产生大量子囊壳[10].不论是野外直接获得的间座壳属Diaporthe真菌标本,还是在实验室分离的间座壳属Diaporthe真菌培养物,都存在着如何保证获得足够多的和成熟的子囊壳用于间座壳属Diaporthe的准确鉴定这一问题.2017年7月——2018年7月,在分离野大豆Glycinesoja内生真菌时,获得了1株间座壳属Diaporthe真菌. 然而,该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上仅产生为数不多的子囊壳,使得不能对其进行准确的物种鉴定. 为此,本研究探索了对野大豆内生间座壳真菌的子囊壳促生培养,并结合形态特征和分子序列对分离和培养的野大豆内生间座壳真菌进行鉴定.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

野大豆GlycinesojaSieb. et Zucc.植株样品于2017年8月7日从山东东营黄河三角洲国家级自然保护区外围区(118o59′9″E,37o45′38″ N)采集,按照Sun等[11]的组织分离法进行内生真菌的分离,分离培养基为改良的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA). 其中,从野大豆叶片中分离的菌株DYYP4342初步鉴定为间座壳属Diaporthe真菌,菌种保存于南京师范大学微生物菌种保藏中心(MCCNNU).

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,水1 000 mL.

水琼脂培养基(WA):琼脂 10 g,水1 000 mL.

改良的PDA:每1000 mL PDA培养基中添加50 mL野大豆汁液.

1.1.3 试剂

乳酸酚棉蓝染色液;5% KOH;2% CTAB;3 mol/L NaAc;氯仿-异戊醇(24∶1);Taq DNA聚合酶;10×PCR buffer、DL2000 Marker;rDNA-ITS的PCR扩增引物由上海生工生物工程技术有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1 子囊壳的促生培养

将长度为5 cm的松针和大豆茎秆分别置于蓝口玻璃瓶中(250 mL),在121 ℃、15 min高压条件下灭菌2次,分别获得灭菌松针、灭菌大豆茎秆. 从PDA平板上生长旺盛的野大豆内生间座壳菌株DYYP4342菌落边缘,以无菌打孔器取直径为10 mm的菌饼,转接到直径为9 cm培养皿中的PDA平板和WA平板上,在培养基上菌饼的两侧平行放置灭菌松针或灭菌大豆茎秆. 设置6组处理,分别是在WA平板和PDA平板上仅接种菌饼、在WA平板和PDA平板上接种菌饼的同时加放灭菌松针或灭菌的大豆茎秆,每组处理3次重复. 在25 ℃,12 h光照培养与12 h暗培养交替处理条件下培养. 培养20 d与30 d后在Nikon C-LEDS 复合显微镜下,用Canon DS126311数码相机拍摄子囊壳的外观特征并进行计数[12]. 因子囊壳聚生,故以子座作为统计单位进行子囊壳的计数.

采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析(ANOVA),采用Tukey检验进行显著性差异检验[13].

1.2.2 形态特征观察

将分离菌株接种于PDA平板上,于25 ℃ 暗培养7 d后,观察菌落正反面的颜色和气生菌丝的疏密程度等菌株DYYP4342的培养特征. 挑取成熟子囊壳,在JSZ6体式显微镜(南京江南永新光学有限公司)下徒手切片. 将切片材料置于载玻片上,滴加5% KOH,再滴加乳酸酚棉蓝染色液,封盖. 在显微镜下观察并利用BX53F显微数码测量系统(Olympus,Japan)测量成熟子囊、子囊孢子的大小,对选定的结构进行30次测量,并计算出平均值和标准差(SD). 范围被表示为min.-max.×min.-max. (mean+SD). 显微图像采用带有微分干涉对比度(DIC)的Imager A1显微镜(Carl Zeiss,Germany)在200×与630×放大倍数下拍摄.

1.2.3 菌株的ITS序列获得和系统发育分析

按照Guo等[14]的方法,用无菌牙签从平板上刮取培养7 d的菌株DYYP4342菌丝体,采用CTAB法提取菌丝DNA. 采用真菌通用引物ITS1-F(5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增核糖体内转录间隔区(rDNA-ITS1),其中ITS1-F为正向引物,ITS4为反向引物. PCR 反应体系为25 μL,含有10×Taq DNA 聚合酶缓冲液 12.5 μL、正向引物和反向引物(10 μmol/L)各 1 μL、DNA样品 1 μL 和灭菌去离子水9.5 μL. 反应条件为 95 ℃预变性2 min;95 ℃变性 1 min,退火50 ℃ 1min,72 ℃延伸 1 min,共30个循环;72 ℃ 延伸7 min. PCR扩增产物质量采用1%琼脂糖凝胶电泳法检测,扩增产物交由上海生工生物工程公司测序.

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中对所测菌株DYYP4342的ITS序列进行BLAST比对. 下载GenBank中豆科植物上发生的12种间座壳属Diaporthe(主要为模式标本分离株ex-type 或附加模式标本分离株 ex-epitype)的30条ITS序列,使用MAFFT 7.0软件(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)对测序序列和下载序列进行在线多序列比对,然后使用MEGA 7.0软件进行比对序列的手动截齐调整. 参照Dissanayake等从GenBank中下载DiaporthellacorylinaCBS 121124 菌株的ITS 序列(KC343004)作为外群,基于贝叶斯推断法(Bayesian inference,BI)使用MrBayes 3.1.2软件构建贝叶斯系统发育树,使用FigTree v1.4.3 与Adobe Illustrator CC2019软件对构建的进化树进行编辑标示.

表1 用于系统发育分析的GenBank中间座壳属真菌的ITS 序列信息Table 1 GenBank accession numbers of Diaporthe species treated in the phylogenetic analysis

2 结果与讨论

2.1 子囊壳在培养基和植物材料上的发生

2.1.1 子囊壳在培养基和植物材料上的培养特征

野大豆内生间座壳菌株DYYP4342在大豆茎秆和松针上都能够产生多于在单纯的PDA平板和WA平板上的子囊壳(图1). 在WA平板,子囊壳发生在菌饼边缘(图1a);当存在有大豆茎秆或松针时,子囊壳既可出现在菌饼边缘,也可出现在大豆茎秆或松针附近,但更多地是在整个大豆茎秆或松针上发生(图1b,c). 在PDA平板上,子囊壳最初发生在菌饼边缘,随着培养时间的延长,子囊壳会散生于在PDA平板各处,一般埋生于PDA内,而以喙突出于培养基外(图1d);当存在有大豆茎秆时,子囊壳既出现在菌饼边缘,也可散生于PDA上,或在大豆茎秆上发生(图1e);当存在有松针时,子囊壳在菌饼边缘、PDA表面和松针上都有发生,但是以松针周围的培养基上发生的最多(图1f).

a-c分别为 WA、WA+灭菌的大豆茎秆和WA+灭菌的松针上的菌落图,d-f分别为PDA、PDA+灭菌的大豆茎秆和PDA+灭菌的松针上的菌落图.图1 野大豆内生间座壳菌株DYYP4342在不同培养基上的生长状态(接种后培养30 d)Fig.1 The colony of endophytic Diaporthe fungal strain DYYP4342 isolated from Glycine soja on different medium(30 days after inoculation)

2.1.2 子囊壳在培养基和植物材料上的发生数量

在培养基上添加无菌大豆茎秆或者松针会明显地促进野大豆内生间座壳Diaporthe菌株DYYP4342子囊壳的产生,且这些子囊壳主要发生在大豆茎秆或者松针上(图2). 野大豆内生间座壳Diaporthe菌株DYYP4342的子囊壳埋生于培养基内或者大豆茎秆、松针内,大多聚生,极少单生,孔口形成较长的喙突出于基质外(图2).

在体式显微镜下对不同培养基不同介质诱导产生的子囊壳的形态进行观察,不同介质诱导产生的子囊壳的成熟度及形状略为不同. 在WA和PDA培养基中,添加无菌大豆茎秆作为诱导介质所产生的子囊壳相较于添加无菌松针作为诱导介质所产生的子囊壳的成熟度要高,并且添加无菌大豆茎秆作为诱导介质所产生的子囊壳为球状而添加无菌松针作为诱导介质所产生的子囊壳更为细长(图2b,e);不添加诱导介质的对照组WA与PDA平板上所产生的子囊壳的形状差异不大(图2a-d).

a-c分别为WA菌饼、WA上灭菌大豆茎秆和WA上灭菌松针上产生的子囊壳,d-f分别为PDA菌饼、PDA上灭菌大豆茎秆和PDA上灭菌松针上的产生的子囊壳,标尺=2 000 μm.图2 野大豆内生间座壳菌株DYYP4342的子囊壳在不同培养基上的发生状态(接种后培养30 d)Fig.2 The perithecium appearancey of endophytic Diaporthe fungal strain DYYP4342 isolated from Glycine sojae on different medium(30 days after inoculation)

A为不同培养基诱导子囊壳的产生(20 d),B为不同培养基诱导子囊壳的产生(30 d). 色柱上方*表示经Tukey检验在P<0.05水平与对照组相比差异显著,**表示经Tukey检验在P<0.01水平与对照组相比差异极显著.图3 不同时间子囊壳的产生个数Fig.3 Number of p produced perithecia at different times

对分离菌株促进产生的子囊壳进行了分析. 结果表明,添加无菌植物材料会促进间座壳属Diaporthe内生真菌子囊壳产生. 培养20 d时在WA培养基中添加大豆茎秆时产生的子囊壳平均值为(88±8.71)个/皿与对照组WA培养基子囊壳数量(3±1)个/皿相比差异极显著(P<0.01). WA培养基中添加无菌松针时产生的子囊壳平均值为(15.3±1.53)个/皿与对照组WA培养基子囊壳数量(3±1)个/皿相比没有显著性差异(图3A). PDA培养基中添加大豆茎秆产生的子囊壳为(63±7.2)个/皿与对照组PDA培养基子囊壳数量(30.3±6.65)个/皿相比差异极显著(P<0.01). PDA培养基中添加无菌松针产生的子囊壳为(53±11.53)个/皿时与对照组PDA培养基(30.3±6.65)个/皿相比子囊壳数量差异显著(P<0.05)(图3A). 培养30 d时在WA培养基中添加大豆茎秆产生的子囊壳为(100±7.81)个/皿与对照组WA培养基(3.3±0.58)个/皿相比子囊壳数量差异极显著(P<0.01). WA培养基上添加无菌松针产生的子囊壳为(57.6±16.56)个/皿与对照组WA培养基(3.3±0.58)个/皿相比子囊壳数量差异极显著(P<0.01)(图3B). 在PDA培养基中添加大豆茎秆产生的子囊壳数量(88.6±13.05)个/皿与对照组PDA培养基(55.3±2.08)个/皿相比子囊壳数量差异显著(P<0.05). 在PDA培养基中添加无菌松针产生的子囊壳数量为(75.6±13.05)个/皿与对照组PDA培养基子囊壳数量(55.3±2.08)个/皿相比子囊壳数量没有显著性差异(图3B).

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态特征鉴定

从野大豆Glycinesoja叶片中分离获得的内生真菌菌株DYYP4342在PDA平板上25 ℃恒温培养7 d,菌落直径可达9.0 cm. 菌丝初期呈白色,边缘规则,气生菌丝发达致密,呈毯状,后期逐渐转为灰色或淡黄褐色. 有性型特征:子囊壳黑色,球状或近球状,聚生,埋生于基质内,具有伸出于基质外的乳突状突起,突起(喙)长728.2 μm～2278.3 μm. (图4B,C);子囊壳直径为261.5 μm～303.2 μm(图4D)无侧丝. 子囊单囊壁,无柄、棍棒状,内含8个子囊孢子,顶端有明显的顶环(图4E,G-J). 子囊大小:(35.18～42.97)×(6.25～8.61)μm(av.±SD:(38.39±1.8)×(7.23±0.58),n=30). 子囊孢子透明,重叠单列,椭圆形或梭状(图4K～L),二室的,有4个水滴状斑点,中间为较大的水滴状斑点,两端则为较小的水滴状斑点,子囊孢子大小:(8.02～11.66)×(2.23～3.54)μm(av.±SD:(9.98±0.75)×(3.03±0.24),n=30)(图4F,K～L). 在所有的培养条件下均未观察到无性型分生孢子器、α型分生孢子和β型分生孢子.

根据形态特征鉴定为大豆间座壳DiaporthesojaeLehman.

宿主-喜树Camptothecaacuminata,辣椒Capsicumannuum,柑橘属Citrussp.,甜瓜Cucumismelo,大豆Glycinemax,向日葵Helianthusannuus,琉璃菊Stokesialaevis,葡萄Vitisvinifera[14-20].在野大豆Glycinesoja上还没有Diaporthesojae的报道.

A在WA+无菌大豆茎秆上的菌落图;B PDA+无菌大豆茎秆诱导产生的子囊壳;C 乳突状突起(喙);D 子囊壳横切图;E子囊;F子囊孢子;G-J子囊;K-L子囊孢子Bars. B=2000 μm;C-D=50 μm;E-L=10μm.图4 大豆间座壳Fig.4 Diaporthe sojae

在野大豆Glycinesoja上还没有Diaporthesojae的报道,已经在栽培大豆Glycinemax上报道的间座壳属Diaporthe真菌则有:Diaporthecaulivora、Diaporthenovem、Diaporthelongicolla、Diaporthephaseolorum、Diaportheaspalathi、Diaportheeres、Diaporthemasirevicii、Diaporthemiriciae、Diaporthesojae、Diaporthemelonis、Diaportheueckerae.尽管野大豆Glycinesoja与栽培大豆Glycinemax是近缘种,是其直接祖先[21],但是,对于大豆间座壳Diaporthesojae而言,野大豆Glycinesoja属于其新被发现的宿主.在野大豆Glycinesoja分离大豆间座壳Diaporthesojae时,选择的是无病害的健康植株组织,因此,该菌是符合内生真菌的定义的[22],而对于其在野大豆中的作用,则需要进一步的研究.

2.2.2 系统发育分析

基于rDNA-ITS构建的贝叶斯系统发育树(图5)表明,分离自野大豆Glycinesoja的间座壳属Diaporthe内生真菌菌株DYYP4342与DiaporthesojaeFAU635、DiaporthesojaeCBS116019和DiaporthesojaeDP0601聚为分支VII,构成一个独立的支系,且获得良好支持(BPP=0.96,BPP=Bayesian posterior probabilities),因此支持了根据形态特征获得的鉴定结果,从野大豆中分离的间座壳属内生真菌菌株是大豆间座壳Diaporthesojae.这一分支中还有发生在向日葵上的DiaporthekochmaniiBRIP54033,本研究结果支持了Udayanga等[15]的基于形态分类学和分子系统学的意见,即Diaporthekochmanii不是一个独立的物种,应归于Diaporthesojae.

贝叶斯分析基于最适模型GTR+I+G. 在系统发育树中,共有12个分支,其中11个分支对应于大豆Glycinemax中已报道的11种间座壳属Diaporthe物种,且每一分支都具有较高的贝叶斯后验概率(图5),支持了这些形态学物种的独立性. 分支Ⅰ为(Hobbs)Santos等[18]最初发现的、已知在阿根廷、美国、中国分布的Diaporthelongicolla;分支Ⅱ为Beraha & O’Brien最初发现的、已知在巴西、德国、美国分布的Diaporthemelonis;分支Ⅲ为Shivas,Thompson & Tan最初发现的、已知在澳大利亚分布的Diaporthemiriciae;分支Ⅳ为Udayanga & Castlebury最初发现的、已知在中国、美国分布的Diaportheueckerae;分支Ⅴ为Shivas,Morin,Thompson & Tan最初发现的、已知在澳大利亚分布的Diaporthemasirevicii;Santos,分支Ⅷ为Vrandecic & Phillips最初发现的、已知在克罗地亚、意大利、南非、美国分布的Diaporthenovem;分支Ⅸ为(Athow & Caldwell)Santos,Vrandecic & Phillips最初发现的、已知在阿根廷、巴西、加拿大、日本、韩国等分布的Diaporthecaulivora;分支Ⅹ为Jansen,Castlebury & Crous最初发现的、已知在阿根廷、南非、美国分布的Diaportheaspalathi;分支Ⅺ为Nitschke最初发现的、已知在中国、意大利等分布的Diaportheeres;分支Ⅻ为(Cooke & Ellis)Saccardo最初发现的、已知在巴西、中国、美国等分布的Diaporthephaseolorum;除11种在大豆Glycinemax上发生的间座壳属真菌外,分支Ⅵ为南非豆科植物南非红茶Aspalathuslinearis上的Diaportheambigua,并且与大豆Glycinemax上的间座壳属真菌具有较密切的亲缘关系.

分支上的值显示的是贝叶斯法推理的后验概率(BPP≥0.85)图5 基于BI的rDNA-ITS序列构建的系统发育树Fig.5 Phylogram generated from Bayesian analysis based on rDNA-ITS regions

3 结论

本研究选择的植物材料大豆Glycinemax为大豆间座壳Diaporthesojae在自然条件下的宿主之一,另一植物材料松针目前尚未报道为Diaporthesojae的宿主.本研究中针对不同植物材料这一影响因素对大豆间座壳Diaporthesojae子囊壳的促进产生进行了比较研究,提供了有一定说服力的结果,不同植物材料对大豆间座壳Diaporthesojae有性型子囊壳的产生结果不同,无菌大豆茎秆在WA和PDA培养基中比无菌松针在WA和PDA平板上促进产生的子囊壳的数量多. 子囊壳促进实验的方法对于间座壳属Diaporthe的其他物种的有性型的人工培养观察具有一定的参考意义,在进行间座壳属Diaporthe物种的有性型的培养中可添加该物种分离的常见宿主植物材料以促进其产生成熟子囊壳. 本实验中对子囊壳进行计数时以子座为单位进行计数这可能会低估了每皿中子囊壳的数量.

通过对成熟子囊壳切片进行形态学鉴定和基于rDNA-ITS进行的系统发育分析,确定了该株分离自野大豆内生真菌的间座壳属Diaporthe的明确物种. Udayanga等对大豆、瓜类植物中的Diaporthesojaecomplex进行了基于ITS/EF/TUB/CAL/HIS的系统发育及致病性分析,认为Diaporthelongicolla、Diaporthephaseolorum、Diaporthesojae、Diaporthemelonis、Diaportheueckerae等属于Diaporthesojaecomplex. 然而,在本研究中仍然将它们作为不同的物种进行完整的形态与系统发育比较. 在本研究中主要用于比较的为从Dissanayake等对间座壳属174个物种的系统发育分析中选择出的在大豆宿主中发现的11个间座壳属物种. 其中在本研究的系统发育树分支Ⅰ中Gomes等将菌株CBS 180.55Diaporthephaseolorumvar.sojae、CBS 659.78Diaporthephaseolorumvar.sojae归为D.sojae. Huang等将CBS 100.87Phomopsislongicolla、CBS 180.55Diaporthesojae归为Diaporthelongicolla. 本研究中在分别使用D.sojae的附加模式标本的分离株(ex-epitype)的序列FAU635与D.longicolla模式标本的分离株(ex-type)的序列ATCC60325进行系统发育树的构建,CBS 180.55D.sojae、CBS 659.78D.sojae、CBS 100.87Phomopsislongicolla与D.longicolla聚类为一支建议可以归入D.longicolla. 分支Ⅲ中分离自甜瓜Cucumismelo的菌株FAU656*为Udayanga等建立Diaportheueckerae时的模式标本的分离株(ex-type),在本研究中发现其与Diaporthemiriciae聚为一支.分离自野大豆的菌株的显微形态与Diaporthephaseolorum很接近,但仔细比对分离自野大豆的菌株DYYP4342子囊孢子的大小为8.02-11.66×2.23-3.54 μm与Udayanga等描述的Diaporthephaseolorum(9.7)12×3.5(-4.3)有略微差异,子囊孢子的宽度要略窄. 子囊孢子大小更接近于Diaporthesojae(9)9.5-11.9(-12)×3-4 μm,并且在系统发育树分支Ⅶ中与物种Diaporthesojae附加模式标本的分离株(ex-epitype)聚类为一支. 故而结合形态与系统发育分析,分离自野大豆的间座壳属菌株应为Diaporthesojae.

本研究从野大豆植株中分离鉴定出的Diaporthesojae为该物种在野大豆宿主中的首次记录.Diaporthesojae建种于1923年,Lehman分离自美国北卡罗来纳州大豆Sojamax(L.)Piper,根据原始文献,Diaporthesojae的名称来源于其宿主Sojamax(L.)Piper,并且子囊壳仅在培养中可出现[23],Diaporthesojae可以感染大豆的茎,豆荚和叶子,引起大豆荚和茎枯病.