七氟烷后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

王晓蕾，郭佳庆，常海宽，高宁宁，张 杰，李晓芳，马闻苛，杨明月，徐璐丹，张红伟，樊 腾，岳修勤

(新乡医学院第一附属医院麻醉科，河南 卫辉 453100)

介入治疗(血管内球囊扩张成形术和支架植入术)和外科冠状动脉旁路移植术是及时恢复冠状动脉阻塞引起的急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者血流、缓解心绞痛、提高生活质量和降低冠状动脉性心脏病死亡风险的有效方法，但心肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI) 是其常见并发症[1-2]。随着冠状动脉旁路移植术的广泛开展，心脏手术过程中不可避免地发生IRI。有研究表明，包括七氟烷在内的吸入麻醉药可以缓解心肌IRI[3]。本研究旨在探讨七氟烷后处理对大鼠心肌IRI的影响，以期为临床心脏手术中IRI的心肌保护及器官移植中的供体保护提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康成年雄性Sprague Dawley大鼠30只，日龄60～80 d，体质量250～300 g，由山东省实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器水合氯醛购自青岛宇龙海藻公司，七氟烷购自上海恒瑞医药有限公司，肝素钠注射液购自江苏万邦生化医疗股份有限公司，大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH) 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司；七氟烷挥发罐购自北京佰泰柯医疗科技有限公司，RGZ-120型体重计购自河南曙光健士医疗器械集团股份有限公司，ALC-V8动物呼吸机和多功能生物信号采集系统购自上海奥尔特生物科技有限公司，普通高速离心机(Scientific PICO17)和全波长扫描酶标仪购自美国Thermo Scientific公司，37 ℃恒温培养箱(B20)购自德国Heraeus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及干预措施将30只大鼠按照随机数字表法分为对照组、缺血再灌注组和七氟烷组，每组10只。3组大鼠的体质量和平均日龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。大鼠适应性喂养1周，12 h 明暗交替，温度20～25 ℃，自由进食水。实验前12 h禁食，但可自由饮水。缺血再灌注组和七氟烷组大鼠制备IRI 模型[4-6]，具体造模方法为：使用100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300 mg·kg-1)。将大鼠四肢、头部仰卧固定于手术台，颈、胸部剃毛，碘伏消毒、铺巾，行正中气管(第3气管软骨环)切开术并行气管插管，连接ALC-V8型动物呼吸机进行人工通气。以针状电极监测大鼠心电图。依次分离大鼠皮下组织、胸前肌肉及筋膜，暴露左冠状动脉，在左心耳下方2 mm处用眼科针3-0丝线穿线，进针深度为1.0～1.5 mm，宽度为2.0～3.0 mm，结扎冠状动脉左前降支。结扎过程要在1～2 min完成，如呼吸不好，胸外人工按摩几次，待自主呼吸稳定后再进行后续实验。冠状动脉结扎后大鼠心肌缺血，随着缺血时间延长，缺血心肌颜色变白，心电图表现为 ST 段抬高和(或)T弓背向上抬高即表明造模成功。缺血再灌注组大鼠冠状动脉结扎30 min后,拔出栓线再灌注120 min；七氟烷组大鼠于再灌注前1 min吸入体积分数2%七氟烷15 min，其余步骤同缺血再灌注组；对照组大鼠手术步骤同缺血再灌注组，但不结扎冠状动脉。缺血再灌注组和七氟烷组大鼠在缺血处理中各死亡1只。整个实验过程均严格按照动物伦理要求。

1.3.2 3组大鼠心率(heart rate，HR)和平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)监测麻醉大鼠后，在大鼠四肢安装心电图导联，连接多功能生物信号采集系统,右颈动脉置管，全程监测并记录大鼠开胸前(T0)、缺血10 min(T1)、缺血30 min(T2)、再灌注30 min(T3)、再灌注60 min(T4)、再灌注120 min(T5)时的HR和MAP。

1.3.3 ELISA法检测3组大鼠血清中cTnI、 CK-MB、 LDH水平缺血再灌注120 min后，于大鼠右颈动脉取血8 mL，肝素抗凝，静置15～20 min，3 000 r·min-1离心10 min，收集血清，于-20 ℃冰箱过夜后置于-70 ℃冰箱保存待用。采用ELISA法检测各组大鼠血清中cTnI、CK-MB、LDH水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，酶标仪检测450 nm波长处吸光度值，建立标准曲线，并计算cTnI、CK-MB、LDH水平。

2 结果

2.1 3组大鼠各时间点HR和MAP比较结果见表1。T3、T4、T5时缺血再灌注组和七氟烷组大鼠的HR和MAP显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。T3、T4、T5时七氟烷组大鼠的MAP显著高于缺血再灌注组，差异有统计学意义(P<0.05)。T0、T1、T2时3组大鼠的HR和MAP比较差异无统计学意义(P>0.05)。T3、T4、T5时缺血再灌注组与七氟烷组大鼠的HR比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 3组大鼠各时间点HR和MAP比较Tab.1 Comparison of HR and MAP of rats among the three groups at different time points

对照组大鼠T1、T2、T4时的HR显著低于T0时，T3、T5时的HR显著高于T0时，T2、T3、T4、T5时的MAP显著低于T0时，T2时的HR显著低于T1时，T3、T4、T5时的HR显著高于T1时，T2、T3、T4、T5时的MAP显著低于T1时，T3、T4、T5时的HR显著高于T2时，T3、T5时的MAP显著低于T2时，T4时的MAP显著高于T2时，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组大鼠T0与T1时的MAP比较差异无统计学意义(P>0.05)，T3、T4、T5时的HR、MAP比较差异无统计学意义(P>0.05)。

缺血再灌注组大鼠T2、 T3、T4、T5时的HR和MAP显著低于T0、T1时，T3、T4、T5时的HR和MAP显著低于T2时，T4、T5时的HR显著低于T3时，T5时的MAP显著低于T3时，T5时的HR和MAP显著低于T4时，差异有统计学意义(P<0.05)。缺血再灌注组大鼠T0与T1时的HR、MAP比较差异无统计学意义(P>0.05)，T3与T4的MAP比较差异无统计学意义(P>0.05)。

七氟烷组大鼠T1、T2、 T3、T4、T5时的HR、MAP显著低于T0时，T2、 T3、T4、T5时的HR、MAP显著低于T1时，T3、T4、T5时的HR、MAP显著低于T2时,差异有统计学意义(P<0.05)。七氟烷组大鼠T3、T4、T5时的HR、MAP比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 3组大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比较结果见表2。缺血再灌注组和七氟烷组大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。七氟烷组大鼠血清中cTn-I、LDH、CK-MB水平均显著低于缺血再灌注组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 3组大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比较Tab.2 Comparison of the levels of serum cTnI，LDH and CK-MB of rats among the three groups

3 讨论

冠状动脉闭塞之后，及时恢复缺血心肌的血流可以迅速限制梗死面积，改善心肌功能，降低急性死亡率，但广泛使用再灌注策略和辅助药物治疗，可导致慢性心力衰竭及缺血再灌注综合征的发病率增加[7-8]。MURRY等[9]首次提出缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)的概念，即短暂的心肌缺血能使心脏耐受更长时间的缺血刺激。但实验研究和临床观察发现，在心肌血流受阻之前，IPC对IRI的心肌有保护作用[10]，因此其临床应用比较局限。七氟烷预处理对心肌的保护作用已得到证实，其具体机制也有报道[11-16]。大量研究发现，七氟烷预处理具有和IPC相似的心肌保护作用，但同样受治疗时机的临床限制[17-18]。药物后处理即通过调节再灌注，包括在再灌注开始时立即引入缺血刺激或挥发性麻醉剂来保护器官可减轻IRI。药物后处理与预处理对IRI的保护机制理论上相似，预处理和后处理关键的生物化学因素均为保护线粒体和减少炎症介质释放。使用药物后处理，相较于缺血预处理可减少有创操作，相较于药物预处理可缓解治疗时机局限性。

吸入麻醉药具有高亲脂性，无特异受体介导，容易跨细胞膜扩散，与细胞膜或细胞质内受体结合形成复合物等优点，因此吸入麻醉药在保护缺血的心肌方面更具优势。七氟烷作为临床上常用的吸入麻醉药，诱导起效快，可控性强，停止吸入后基本上通过呼吸迅速排泄，停止吸入后肺泡内浓度迅速降低，对呼吸和循环影响小[19]。

缺血再灌注可通过细胞内钙超载、细胞线粒体能量代谢障碍以及氧自由基损伤等机制，造成心肌细胞损伤或坏死，继而引发细胞膜通透性改变，导致心肌细胞胞质物质(心肌酶和心肌蛋白)释放入血。心肌酶是临床检测心肌细胞损害程度的重要指标。有研究发现，CK-MB广泛存在于心肌细胞中,是临床诊断心肌损伤的有效指标，当冠状动脉性心脏病患者发生典型胸痛时，CK-MB水平将在3～8 h升髙，16～24 h达到髙峰，3 d后逐渐恢复正常，对预测冠状动脉病变程度具有良好效果;LDH广泛存在于人体各个组织中，多见于心肌细胞中，冠状动脉性心脏病患者发生急性心肌梗死后12～24 h LDH水平逐渐升高，48～72 h达到高峰，10～12 d恢复正常，同时随着冠状动脉病变支数的增加，LDH水平逐渐增高，临床多将LDH应用于心肌梗死的诊断中[20]。cTnⅠ是反映心肌细胞急性损伤的指标，具有较高特异性，于冠状动脉性心脏病患者典型胸痛发生后1～6 h开始升髙，诊断窗口期为4～8 h[21]。有研究发现，在短时间内的心肌缺血刺激下，心脏可大量释放cTnI，通过对cTnI水平的检测可有效判断心肌受损面积，且可作为微小心肌损伤的早期标志[22]。 cTnI和CK-MB是心肌损伤时最敏感的特异性指标，其数值大小与心肌损伤程度呈正相关。本研究结果发现，缺血再灌注组和七氟烷组大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均显著高于对照组，七氟烷组大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均显著低于缺血再灌注组，提示七氟烷后处理可以减少血流再灌注后心肌损伤，降低心肌损伤标志物cTnI、LDH和CK-MB水平，间接表明七氟烷后处理可以减少IRI引起的心肌损伤。

本研究选择雄性大鼠为研究对象，排除了性别差异(雌激素)对实验的影响。本研究采用经典的结扎左冠状动脉前降支的方法制作IRI模型，易于操作，可行性强。本研究通过监测大鼠不同时间点血流动力学发现，T0、T1、T2时3组大鼠的HR和MAP比较差异无统计学意义，可能是由于缺血再灌注前机体应激反应及自身调节，使缺血再灌注组、七氟烷组大鼠血流动力学与对照组比较无明显变化。本研究结果发现，T3、T4、T5时缺血再灌注组和七氟烷组大鼠的HR和MAP显著低于对照组，提示再灌注后可能由于氧自由基的增多、钙离子超载、炎症因子释放等因素导致心肌损伤加重；且T3、T4、T5时七氟烷组大鼠的MAP显著高于缺血再灌注组，表明七氟烷后处理改善了IRI大鼠的心肌血流。本研究结果发现，对照组大鼠T1、T2、T4时的HR显著低于T0时，T3、T5时的HR显著高于T0时，T2、T3、T4、T5时的MAP显著低于T0时，T2时的HR显著低于T1时，T3、T4、T5时的HR显著高于T1时，T2、T3、T4、T5时的MAP显著低于T1时，T3、T4、T5时的HR显著高于T2时，T3、T5时的MAP显著低于T2时，T4时的MAP显著高于T2时。说明对照组大鼠T0～T2时的HR和T1～T3的MAP明显下降，可能与手术初期水合氯醛对大鼠心血管系统的抑制有关。本研究结果发现，缺血再灌注组大鼠T2、 T3、T4、T5时的HR和MAP显著低于T0、T1时，T3、T4、T5时的HR和MAP显著低于T2时，T4、T5时的HR显著低于T3时，T5时的MAP显著低于T3时，T5时的HR和MAP显著低于T4时，说明缺血再灌注组大鼠T2～T5时的HR和MAP明显下降，提示大鼠心肌IRI造模成功。本研究结果发现，七氟烷组大鼠T1、T2、 T3、T4、T5时的HR、MAP显著低于T0时，T2、T3、T4、T5时的HR、MAP显著低于T1时，T3、T4、T5时的HR、MAP显著低于T2时,T3、T4、T5时的HR、MAP比较差异无统计学意义，说明七氟烷组大鼠T1～T3时的HR、MAP明显下降，而T3～T5时的HR、MAP变化不大，提示七氟烷使大鼠再灌注过程中血流动力学指标相对平稳。

综上所述，七氟烷后处理可改善IRI大鼠心肌的血流供应，减少心肌标志物cTnI、LDH和CK-MB的释放，改善再灌注后心肌损伤，对IRI的心肌有一定的保护作用。由于本研究样本量有限，未对不同吸入浓度七氟烷对缺血再灌心肌影响做对比，可以进一步扩大样本量研究不同浓度七氟烷对缺血心肌的影响，为临床应用提供更多的参考价值。