沙棘籽多酚超声耦合真空提取工艺的研究

李颜桃 仲崇华 张健荣 曲逸文 毕师诚,4,5 马 跃,4,5 赵婵娟 曹立亭,4,5

(西南大学动物医学院中兽医学系1，重庆 402460) (四川省资阳市乐至县农业农村局2，资阳 641500) (西南大学动物科学技术学院3，重庆 402460) (重庆市兽医科学工程研究中心4，重庆 402460) (西南大学中兽医药研究所5，重庆 402460) (重庆三峡职业学院6，重庆 404155)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)作为藏药“四大金刚”之首(沙棘、冬虫夏草、藏红花、雪莲)，属胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)[1]。早在1300年前，唐代《四部医典》中就有80余处记载了沙棘，并被尊为“西域圣果”[2]。《中国药典》中将其列为珍贵的药食两用品种，兼备经济价值与生态价值，在中国分布面积大，且种类丰富[3，4]。据研究报道，沙棘富含30余种多酚类化合物，主要为黄酮类、原花青素类、酚酸类等活性物质，广泛存在于沙棘果、叶、茎、根等不同器官中[5-9]。Korekar等[10]观察到酚类物质含量与沙棘各部分提取物的抗氧化能力之间存在显著相关性，其中树皮表现出最强的抗氧化特性，其次是种子、叶子和果肉。相比其他鲜果如黑醋栗(25 mg/100 g)、草莓(20 mg/100 g)和覆盆子(25 mg/100 g)等[11]，沙棘果是酚类化合物的更好来源(260～490 mg/100 g)，具有抗氧化、抗神经退行及增强免疫等多种生理功效，可治疗肝脏疾病、妇科疾病等[12-17]。

近年来，植物多酚的提取分离技术及药理作用已引起研究者广泛关注。常用的酚类物质提取方法有溶剂萃取法[18]、超声波辅助提取法[19]、微波辅助提取法[20]、生物酶法[21]等。其中，超声波提取技术是通过压电换能器产生的快速机械振动波来减少目标萃取物与样品基层之间的作用力，从而实现固-液萃取分离；其特有的空化效应，产生无数内部达到千个大气压的微气穴，并不断“爆破”产生微观上的强大冲击波，均匀作用在沙棘籽渣上，冲击流对细胞组织产生一种物理剪切力，使之变性、破裂，“轰击”多酚至逸出，游离于乙醇溶液中[22]，加速了提取过程；同时超声提取法具有操作便利、得率较高等优点。此外，减压提取法应用于中药提取，主要是通过抽真空降低了热敏性活性物随温度升高造成的氧化和降解，且使体系更活跃，从而加快提取速率[23]。近年来，植物多酚作为天然产物的提取技术及其开发应用已成为科研工作人员的研究热点。然而，以往研究中对沙棘籽多酚的提取方法报道较少，优化多酚提取工艺对深入推进沙棘废弃工业原料的综合利用具有重大意义，为沙棘籽后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新疆沙棘干果，经西南大学动物医学院刘娟教授鉴定为胡颓子科沙棘属新疆沙棘(Hippophaerhamnoides)的干燥果实。福林酚、没食子酸标准品(纯度：HPLC≥98%)，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TAS-98紫外分光光度计，RE-5000旋转蒸发仪，SHZ-III循环水式多用真空泵，DHP-9212型电热恒温培养箱，BPS-5200DT超声波清洗机，原泰奇气引式粉碎机。

1.3 方法

1.3.1 沙棘干果的预处理

室温浸泡洗净的沙棘干果12 h，人工捣捶分离沙棘果肉与籽，滤出沙棘籽，置60 ℃烘箱烘干，磨碎后用筛网筛出粗粉。采用10倍体积石油醚(沸程60～90 ℃)室温下浸泡沙棘籽1 h后，70 ℃回流1 h并抽滤，重复3次，弃去滤渣，自然晾干后得到脱脂沙棘籽粉末[24]。

1.3.2 没食子酸标准曲线的建立

精确称取 25 mg没食子酸，用70%乙醇溶液定容至25 mL，得到质量浓度为1.0 mg/mL的没食子酸标准溶液。量取1 mL的1.0 mg/mL没食子酸标准溶液，将其稀释后配成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的标准液，按照福林法测吸光度。以没食子酸质量浓度为横坐标，765 nm处的吸光度值为纵坐标，重复3次，绘制标准曲线，进行回归分析。

1.3.3 沙棘籽多酚含量的测定

量取待测液 2.0 mL，移入50 mL容量瓶中，加入1.0 mL福林酚试剂，充分混匀后静置2 min，加入10 mL 7%Na2CO3溶液，充分混合后以蒸馏水定容，置30 ℃恒温水浴锅中反应1 h，每隔15 min振荡1次。取出后，在波长765 nm处测定吸光度值(以蒸馏水为空白对照)，多酚含量以没食子酸计(mg/g)。

式中：C为换算得到的多酚质量浓度/mg/mL；V1为样品总体积/mL；V2为量取样品测定定容体积/mL；V3为测定用样品体积/mL；M为样品质量/g。

1.3.4 提取工艺单因素考察

取脱脂沙棘籽粉末1.5 g，预设超声功率210 W、液固比15∶1、超声温度40 ℃、超声时间30 min为提取工艺中的常规量。在超声功率分别为120、165、210、255、300 W，液固比(g/mL)分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，超声温度为(30、40、50、60、70 ℃)，超声时间为(10、20、30、40、50 min)条件下，由此4个单因素变量分别替换提取工艺中相应的常规量，耦合真空条件，控制压强在1.5～2.5 kPa之间，重复实验3次，得多酚样品。

1.3.5 响应面实验设计与分析

在单因素实验基础上，选取对多酚含量有显著差异的因素，确定不同因素及水平值，运用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken响应面试验设计与数据分析。

1.3.6 数据分析

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线的建立

由图1可知，没食子酸在质量浓度0～0.25 mg/mL内与吸光值呈良好的线性关系，在此范围内的线性回归方程为：Y=3.917X+0.064 9，R2=0.996 7。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 单因素实验

由图2所示，以不同超声功率为横坐标，多酚得率为纵坐标作图。不同超声功率对多酚得率有显著性差异(P< 0.05)。考虑到超声功率过高可导致多酚部分降解，故其水平值选取在300 W范围内，结果表明多酚得率随提取功率的增加呈升高趋势，功率为300 W时得率最高。

以不同液固比为横坐标，多酚得率为纵坐标作图。不同液固比下，沙棘籽多酚得率之间存在显著性差异(P<0.05)，且随液固比增加呈现先增加后降低的趋势。可能由于液料比在15∶1左右时溶剂对多酚的溶解已基本达到饱和，继续增加溶剂用量，并不能显著提高多酚的提取得率。由此可知，最佳提取液固比为15∶1左右。

以不同提取时间为横坐标，多酚得率为纵坐标作图。沙棘籽经不同时间提取后，多酚得率呈现显著差异(P<0.05)，且多酚得率在提取时间为30 min时最高，超过30 min后得率呈下降趋势。提取时间过长导致得率下降的原因可能是多酚类物质在长时间提取下发生氧化变质。

不同温度下，多酚得率之间存在显著性差异(P<0.05)。温度低于50 ℃时，多酚得率随温度的升高不断增加，当温度超过50 ℃后得率呈下降趋势，提示多酚的适宜提取温度在50 ℃前后。这与倪玉娇等[25]在超声辅助低共熔溶剂提取沙棘籽粕多酚的工艺优化中确定的最佳提取温度45 ℃大致相当。高温可使细胞壁渗透性增强，增加提取物的溶解度和扩散系数，降低溶剂的黏度，从而提高得率。但温度过高时会引起酚类化合物的降解，产生内部的氧化还原及聚合反应，致使多酚得率不再上升。

图2 各提取因素对多酚得率的影响

2.3 响应面优化提取工艺

2.3.1 响应面实验设计与结果

根据单因素实验结果，选取各因素下多酚得率相对更高的水平作为设计参照，结合Box-Behnken中心组合，确定响应面分析的因素与水平，采用超声功率(A)、液固比(B)、提取时间(C)和提取温度(D)进行4因素3水平实验设计，具体试验因素与水平值见表1。

表1 Box-Benhnken响应面实验因子与水平

表2 响应面实验结果

2.3.2 模型的建立与方差分析

运用Design-Expert 8.0.6软件对表2实验数据进行多元回归拟合，得到沙棘籽多酚得率对超声功率、液固比、提取时间和提取温度的二次多项回归模型为：

得率=11.10+0.27A+0.91B+0.51C+0.48D-0.38AB-0.19AC+0.66AD-0.27BC+1.33BD+0.14CD-1.61A2-1.08B2-2.76C2-2.37D2

对模型进行方差分析，由表3可知，模型的F值为115.25，P<0.01，说明该模型有意义。失拟项F值为0.67，P=0.721 7不显著，说明模型拟合良好。由表4可知多元相关系数R2=0.991 4，表明模型拟系数的相关性较好。信噪比为32.794，大于4，表明有足够信号强度。在该回归模型下A、B、C、D、AB、AD、BD、A2、B2、C2、D2对多酚得率影响显著。

表3 回归方程系数显著性检验表

表4 回归模型的方差分析

2.3.3 响应面分析

以沙棘籽多酚得率为响应值，固定1个因素于中心水平，分析另外2个因素及其交互作用对多酚得率的影响。液固比和超声功率对多酚得率的交互作用极显著(P<0.01)。当液固比一定时，随着超声功率的增大，多酚得率增大，超声功率继续增大，多酚得率有下降趋势；当超声功率一定时，随液固比的增大，多酚得率先增大后减小。提取时间和超声功率存在交互作用，当超声功率一定时，随着提取时间的延长，多酚得率先增大，但时间超过一定值时，多酚得率呈下降趋势。当提取时间一定时，随液固比的增大，多酚得率先增大后减小；提取温度和超声功率对多酚得率存在交互作用。当提取温度一定时，随超声功率的增大，多酚得率呈下降趋势。当超声功率一定时，多酚得率随温度的升高而增大，其等高线为椭圆形可表明提取温度和超声功率交互作用极显著。提取时间和液固比对多酚得率的交互作用。液固比一定时，随着提取时间的延长，多酚得率先增大后趋于平缓。当提取时间一定时，随液固比的增大，多酚得率呈先增大后减小的趋势。超声温度和液固比对多酚得率的交互作用极显著。液固比一定时，随着提取温度的升高，多酚得率逐渐升高，后趋于平缓，当提取温度一定时，随液固比的增大，多酚得率先增大后降低。提取温度和提取时间对多酚得率的交互作用不明显。在低功率范围内，随提取时间延长，多酚得率增大，当功率超过一定值时，得率减小。当提取时间一定时，随温度的升高，多酚得率不断增大，最终趋于平缓。

2.3.4 最佳提取工艺的确定与验证

根据回归方程分析可知，沙棘籽多酚最大得率对应的提取条件为超声功率260.65 W，液固比17.07∶1，超声时间30.33 min，提取温度52.76 ℃。在此条件下多酚得率的理论值为11.422%。为验证模型是否可靠，从方便可行角度考虑，选取超声功率260 W，液固比 20∶1，超声时间30 min，超声温度52 ℃为沙棘籽粉末最佳提取工艺。经验证，此条件下多酚得率为(11.394±0.083)%，与模型理论预测值(11.422%)无显著差异(P>0.05)。

3 结论

本研究通过单因素实验对沙棘籽多酚超声耦合真空提取的超声功率、液固比、超声时间、超声温度进行考察，并结合四因素三水平的响应面分析法对沙棘籽粉末提取工艺进行了优化，得到最佳提取工艺条件：超声功率260 W，液固比 20∶∶1，超声时间30 min，超声温度52 ℃。在此工艺条件下沙棘籽多酚得率达到(11.394±0.083)%。本条件节能省时，操作方便，为沙棘籽多酚大规模工业化生产提供了参考依据。