甘薯块根多酚高效测定技术优化与应用

高志远 胡亚亚 韩美坤 张 静 于翠红 赵俊梅,2 刘兰服 焦伟静 马志民

(河北省农林科学院粮油作物研究所；河北省作物遗传育种实验室1，石家庄 050035) (河北科技大学生物科学与工程学院2，石家庄 050018) (河北省种子总站3，石家庄 050031)

甘薯作为全球种植的主要作物之一，是重要的粮食、饲料、工业原料及新型能源作物[1]。甘薯营养成分丰富，含有淀粉、蛋白质、多酚、维生素、纤维素等，具有营养保健作用[2，3]。多酚是甘薯诸多营养保健成分之一，因其结构中含有多个酚羟基而具有良好的抗氧化活性及清除自由基的作用，据研究报道甘薯多酚具有明显的抑菌活性和抗氧化作用[2-7]。另外多酚类化合物还具有抗癌、降血脂、抗衰老等众多作用，被称为人类健康的“第七营养素”，因此逐渐成为研究的热点[8，9]。

多酚含量测定的方法有很多，福林酚比色法因其灵敏度高、稳定性好而广泛应用[10-13]，其原理为在碱性溶液中，钨钼酸可以将多酚类化合物定量氧化，自身被还原(使W6+变为W5+)生成蓝色的化合物，颜色的深浅与多酚含量呈正比[14，15]。目前，已有研究分别用福林酚比色法测定了甘薯不同部位的多酚含量，但均为分光光度计测定[16-18]。随着科学技术的发展，酶标仪的应用越来越广，它具有效率高、操作简单的特点，避免了反复清洗比色杯，同时减少试剂使用量，节约成本[19-22]。胡炜等[23]采用酶标仪结合福林酚法测定了葡萄皮的多酚含量。然而，研究报道的福林酚法测定多酚含量的条件差异较大[24]。

建立甘薯多酚高效测定方法是开展甘薯种质及育种后代筛选评价的基础，对于高多酚甘薯品种的开发利用具有重要意义。因此，本研究将酶标仪与福林酚法结合，优化反应体系和时间，以建立甘薯多酚测定的高效方法，并对所保藏的甘薯种质资源进行多酚含量测定，为选育高多酚甘薯品种，更好地开发利用甘薯种质资源提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘薯：本实验室保存的甘薯种质资源83份。

没食子酸标准品及福林酚试剂；乙醇、碳酸钠(Na2CO3)均为分析纯。

FSJ-A03D1粉碎机，TG16G台式高速离心机，SynergyMx多功能酶标仪，96孔板，eppendorf微量移液器。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制

没食子酸母液：取没食子酸标准品10 mg加蒸馏水定容至10 mL棕色容量瓶，质量浓度为1 mg/mL，避光存放于-20 ℃冰箱。

没食子酸工作液：以1 mg/mL没食子酸母液分别配制质量浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的没食子酸工作液。

1.2.2 样液的制备

参考GB/T 8313—2008[25]方法并有所改进，取同品种大小均匀的3个薯块，洗净，晾干，去皮，采用四分法取样，擦丝，用粉碎机打碎，分别称取1.00 g，加70%乙醇溶液2 mL研磨均匀，转入10 mL离心管，用2 mL70%乙醇溶液冲洗研钵2次，将冲洗液均转入10 mL离心管，混匀后立即70 ℃水浴，浸提10 min (隔5 min混匀一次)，浸提后冷却至室温，5 000 r/min离心10 min，上清液转移至10 mL容量瓶，残渣用5 mL 70%乙醇溶液提取，重复以上操作。合并提取液定容至10 mL，混匀，即为样液。

1.2.3 提取溶剂浓度的确定[26]

配制40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，参考上述方法，对甘薯块根多酚进行提取，以确定最优提取溶剂浓度。

1.2.4 样品测定条件优化[27]

参考GB/T 8313—2008[25]，分别取不同浓度的没食子酸工作液、蒸馏水(空白对照)及样液各200 μL于5 mL离心管，各3个平行，分别加入1 mL 10%福林酚试剂，摇匀，反应5 min，加入800 μL 7.5%碳酸钠溶液摇匀，室温下避光放置60 min，在96孔板中每孔加入330 μL，在765 nm波长测定吸光度。

1.2.4.1 碳酸钠溶液浓度的确定

分别配制2.5%、5%、7.5%、10%、15%碳酸钠溶液，以确定的最适浓度乙醇提取甘薯多酚，按上述方法进行实验测定，加入不同浓度的碳酸钠溶液反应，以确定最优碳酸钠溶液浓度。

1.2.4.2 福林酚浓度的确定

分别配制2.5%、5%、10%、15%、20%福林酚溶液，以确定的最适浓度乙醇提取甘薯多酚，按上述方法进行实验测定，加入不同浓度的福林酚进行反应，加入确定浓度的碳酸钠溶液后，对甘薯多酚含量进行测定，以确定最适福林酚浓度。

1.2.4.3 反应时间的确定

按确定的条件反应加入碳酸钠后，每隔10 min测定一次，以确定最佳反应时间。

1.3 分析方法的评价[10]

1.3.1 线性范围的确定

以没食子酸为标准品，配制质量浓度为20、40、60、80、100 μg/mL的没食子酸工作液。以蒸馏水为空白对照，按确定的条件进行测定，以765 nm吸光度为Y轴，以没食子酸浓度为X轴，绘制标准曲线，确定线性范围。

1.3.2 方法重复性评价

取5份甘薯样品，以最佳的乙醇浓度进行多酚提取，按确定的最佳条件测定765 nm吸光度，计算相对标准偏差，以确定实验的重复性。

1.3.3 显色液稳定性评价

以确定的最佳乙醇浓度对甘薯块根多酚进行提取，在确定的最佳条件下测定，反应60 min后，在2 h内每隔30 min测定一次吸光度，计算其相对标准偏差，以确定显色液稳定性。

1.3.4 加标回收实验[28]

分别取3份已知多酚含量的甘薯块根样品各1.00 g，分别加入200 μg没食子酸标准品，按上述确定的最佳条件测定多酚含量，计算没食子酸标品回收率和相对标准偏差，评价方法的可靠性。

1.3.5 准确性评价

选取10份甘薯样品，同时按GB/T 8313—2008[25]和优化的方法进行甘薯多酚含量测定，比较优化方法与GB/T 8313—2008方法的差异。

1.4 83份甘薯种质多酚含量测定

由于所测甘薯样品较多，为保证样品测定条件一致，首先将所有甘薯样品统一进行预处理，具体做法为：

每个甘薯品种取大小均匀的3个薯块，洗净，晾干，去皮，采用四分法取样，擦丝，粉碎机打碎，分别称取1.00 g，加70%乙醇溶液2 mL研磨均匀，转入10 mL离心管中，用2 mL 70%乙醇溶液冲洗研钵2次，冲洗液均转入离心管中，-20 ℃保存。

1.5 数据处理

应用SPSS21.0及Excel 2010软件对实验结果数据进行分析整理，实验结果所得的数据表示为平均值±SD。

2 结果与分析

2.1 最佳提取溶剂浓度的确定

通过设置不同的提取溶剂浓度，对各浓度下的提取效果进行评价，确定最佳的提取溶剂浓度，其结果见图1。

图1 提取和显色反应条件实验结果

由图1可以看出，提取溶剂乙醇体积分数在40%～90%范围内，随着提取溶剂乙醇浓度的提高，吸光度逐渐增加，到达70%时，吸光度值取得最大值，继续增加乙醇浓度则吸光度降低，表明用70%乙醇提取甘薯块根多酚效果最佳。

2.2 碳酸钠溶液浓度的确定

福林酚试剂与酚类化合物反应后在碱性条件下才可显色，碳酸钠溶液则为反应体系提供碱性环境，其含量影响着显色反应效果。通过设置不同的碳酸钠浓度，根据显色效果确定最佳碳酸钠浓度，结果如图1所示。当碳酸钠溶液质量分数为5%时，765 nm处的吸光度最大，因此确定碳酸钠溶液质量分数最佳为5%。

2.3 福林酚溶液浓度的确定

通过设置不同的福林酚溶液浓度，比较各浓度下的吸光度值，从而确定最佳的福林酚浓度，结果如图1所示。以70%乙醇进行甘薯块根多酚的提取，提取液中加入不同浓度的福林酚溶液，再加入确定的最优浓度碳酸钠溶液，进行测定，由图1可以看出，随着福林酚溶液浓度的增加，吸光度不断增加，在15%时，吸光度达到最大值，之后吸光度降低，表明福林酚的最适体积分数为15%。

2.4 最佳反应时间的确定

按上述优化的反应条件进行测定，每隔10 min测定一次吸光度，比较评价不同反应时间对甘薯块根多酚含量测定的影响，结果见图1。随着反应时间的增加，吸光度不断增大，到达60 min后趋于稳定，因此确定最优反应时间为60 min。

甘薯多酚测定的最佳反应条件为：样液各200 μL，加入1 mL 15%福林酚试剂，摇匀，反应5 min，加入800 μL 5% 碳酸钠溶液，摇匀，室温下避光放置60 min，在96孔板中每孔加入330 μL，设定酶标仪参数，在765 nm波长测定吸光度。

2.5 分析方法的评价

2.5.1 线性范围的确定

取不同浓度的没食子酸工作液，以蒸馏水为空白对照，按确定的条件进行测定。以765 nm吸光度为Y轴(均减去空白对照值)，以不同没食子酸浓度为X轴，绘制标准曲线。没食子酸质量浓度在0～100 μg/mL范围内线性良好，回归线方程为Y=0.009 6X+0.019 7,R2= 0.997 2。

2.5.2 方法的重复性评价

取甘薯样品5份，以最佳的乙醇浓度进行多酚提取，按优化后的条件对样品进行福林酚法测定，5份样品测定结果如表1所示： 相对标准偏差为1.57%，表明优化后的方法的重复性良好。

表1 重复性实验结果

2.5.3 显色液稳定性评价

以确定的最佳乙醇浓度对甘薯块根多酚进行提取，采用优化后的条件进行测定，反应60 min后，在2 h内每隔30 min测定一次吸光度，测定结果如表2所示，相对标准偏差为0.81%，表明显色液稳定性良好。

表2 显色液稳定性结果

2.5.4 加标回收实验

按上述优化后的条件进行加标回收实验，结果如表3所示。

表3 加标回收实验结果

由表3可知，平均加标回收率为98.4%，相对标准偏差为2.4%，表明该方法准确可靠，可用于甘薯多酚含量测定。

2.5.5 准确性评价

应用优化的多酚含量测定方法与国标法同时测定10份甘薯样品多酚含量，评价新建方法的准确性，结果如表4所示。两种方法测定甘薯多酚含量结果差异均不显著，表明优化后的方法测定结果准确可靠，且具有高效、经济的特点。

表4 优化法和国标法测定甘薯多酚含量结果

2.6 83份甘薯种质多酚含量测定

应用上述优化确定的方法，对本实验室所保藏的83份甘薯种质资源进行多酚的提取及含量的测定，以筛选出多酚含量较高的品种，测定结果见表5。

由表5可以看出，所测定甘薯品种块根中多酚含量范围在0.22～2.00 mg/g鲜样之间，其中多酚含量最高的为漯紫薯4号(2.00 mg/g鲜样)，其次为徐紫薯8号、烟紫薯3号、临薯15051、冀薯7-20、冀紫薯3号等；不同品种甘薯多酚含量差异较大，且紫肉品种中的多酚含量均高于其他薯肉品种。

进一步对所有甘薯样品的测定结果进行分布频率统计分析，结果见图2。由图2可以看出，多酚质量分数大于1.5 mg/g的1个，占总样品量的1.20%，在1.0～1.5 mg/g之间的3个，占总样品量的3.61%，在0.5～1.0 mg/g之间的17个，占总样品量的20.48%，在0.4～0.5 mg/g之间的30个，占总样品量的36.14%，在0.3～0.4 mg/g之间的30个，占总样品量的36.14%，在0.2～0.3 mg/g之间的2个，占总样品量的2.41%。

表5 83份甘薯种质多酚含量(鲜样)

图2 甘薯品种多酚含量频率分布图

3 讨论

在甘薯多酚测定中，研究报道的样品处理方式多采用干燥处理，如晒干、烘干、冻干等[10,29,30]，然而，不同的干燥方式均会对甘薯多酚含量造成一定的影响[31]，本研究直接选择鲜样进行多酚的提取与测定，降低了多酚损耗；另外在甘薯多酚含量批量检测中，为防止甘薯样品中多酚含量在存放期间发生变化，本研究在测定开始前对待测样品进行统一预处理：加提取剂研磨后转10 mL离心管于-20 ℃冰箱保存待测。

在提取溶剂的选择方面，本研究参考前人研究结果[16,30-33]，选取乙醇作为提取溶剂，并对其浓度进行优化，通过设置浓度梯度实验，确定乙醇体积分数在70%条件下提取效果较好。

目前，国内外关于甘薯多酚含量测定的报道相对较少，本研究选择了应用较广泛的福林酚比色法。由于酶标仪与分光光度计原理相似[19]，应用96孔板代替比色杯，操作简单，适宜批量检测，节约成本。本研究将福林酚比色法与酶标仪相结合，对试剂浓度和反应时间等测定关键条件进行优化集成，具有准确性高，重复性好，适宜批量测定等优点，且在检测效率上，较国标法可提高约3倍。

应用本研究所建立的方法对样品进行测定，结果发现不同甘薯品种间多酚含量差异较大：在0.22～2.00 mg/g鲜样之间，张文婷等[31]也报道了甘薯薯块鲜样的多酚含量在0.44～2.16 mg/g之间，本研究所测含量中最高、最低含量均较低。可能与所测品种、生长地点以及测定方法条件不同有关。陆国权等[16]研究发现甘薯多酚含量的基因型差异和环境效应差异显著。此外，本研究发现紫肉品种中的多酚含量高于其他品种甘薯，与唐忠厚等[30]和张文婷等[31,34]报道结果一致。在所测定品种中多酚含量最高的是漯紫薯4号(2.00 mg/g鲜样)，因此可对其进行进一步的开发利用。

对于甘薯多酚含量的测定，本研究仅对设定的水平进行了单因素实验，无法考察到未设定水平对实验的影响，有必要进一步对各因子水平及其交互作用进行系统优化。此外，福林酚法测定的为总多酚含量，今后应进行更全面、更深入的研究确定甘薯多酚的具体组成成分，以期为甘薯多酚的进一步开发利用提供更全面的依据。

4 结论

本研究确定了甘薯多酚最佳提取溶剂乙醇的体积分数为70%，建立了福林酚法结合酶标仪高效测定甘薯多酚含量的方法，确定最佳测定条件为福林酚体积分数15%，碳酸钠质量分数5%，反应时间60 min。本方法平均加标回收率为98.4%，相对标准偏差为2.4%。该方法准确性高，重复性好，可高效测定甘薯多酚的含量。对甘薯样品进行测定，其多酚质量分数在0.22～2.00 mg/g鲜样之间，其中紫肉品种甘薯多酚含量较其他品种甘薯的高，开展高多酚品种的培育时可将紫甘薯作为重点。