青钱柳幼嫩与成熟叶片代谢组学数据比较分析

林伟达，李钧敏

（1.台州科技职业技术学院 人文教育学院，浙江 台州 318000；2.台州学院 浙江省植物进化生态学与保护重点实验室，浙江 台州 318000）

0 前言

青钱柳（Cyclocarya paliurus（Batal）Ijinskaja）又名青钱李、摇钱树，是胡桃科（Juglandaceae）青钱柳属（Cyclocarya）植物。青钱柳是单种属植物，为第四纪冰期孑遗物种，是我国特有的珍稀濒危保护植物［1−2］。

据《中国中药志要》记载，青钱柳树皮、树叶具有清热解毒、止痛功能，可用于治疗顽癣。民间常用其叶片做茶，因其味甜有清热解暑、降糖、降压的功效，又称为甜茶、神茶等［3］。有关青钱柳化学成分及药效的研究始于20世纪70年代，对其理化成分及药理作用研究则始于20世纪80年代中期［4］。研究发现饮用青钱柳叶茶能抑制人体对葡萄糖的吸收，有效控制糖尿病患者的血糖水平，提高对葡萄糖的糖耐量，又可以使病变的胰岛结构功能逐步得到恢复［5−7］。多年研究发现青钱柳主要含有多糖、黄酮、三萜皂苷、微量元素等化学成分，具有多方面的药理活性，尤其在降血糖和降血脂方面具有独特的疗效［5，8−12］。2013年10月，国家卫计委批准青钱柳叶加入新资源食品目录［13］。

代谢组学能够定性定量地分析生物体在某一特定生理时期内（如将某个特定的基因变异或环境变化后）的代谢产物的变化或其随时间的变化，从而研究生物体的代谢途径［14］。通过植物代谢组学的研究，可以了解同一植物的不同时期或不同部位的代谢途径及代谢物含量变化，能够提高植物产品品质［15］。范文强等［16］利用代谢组学研究表明中花期收获的苜蓿更宜青贮，而现蕾期收获的苜蓿更宜调制干草。郝亚利［14］通过代谢组学揭示了氨基酸、黄酮、儿茶素等代谢产物在不同叶龄茶鲜叶中含量变化，有助于茶叶的品种改良和鲜叶品质调控。Tajidin等［17］利用代谢组学分析穿心莲幼叶和成熟叶的代谢产物差异，结果表明第18周收获的穿心莲幼叶可作为生产优质植物提取物的最佳原材料。Lawal等［18］提出植物代谢物含量的可变性可能受到多种因素的影响，包括植物的收获年龄阶段。

有关青钱柳叶片不同发育阶段代谢组学的相关研究报道并不多，仅见本实验室基于高效液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography tandem mass spectrometry technology，LC-MS-MS）技术，利用代谢组学分析了四个不同发育阶段青钱柳叶片黄酮类化合物［19］和酚酸类化合物［20］组成，并结合转录组学分析了可能的黄酮类化合物、酚酸类化合物的合成代谢途径，为青钱柳叶片相关代谢物的综合利用提供了理论依据。在青钱柳叶片的加工过程中，青钱柳的幼嫩叶片常用于开发青钱柳茶叶，而成熟的叶片常用于开发青钱柳叶片相关产品，但这种利用方式缺乏具体的理论依据。本文基于LC-MS-MS技术，比较分析了青钱柳幼嫩与成熟叶片氨基酸、黄酮、三萜类化合物等主要化学成分的差异，旨在为青钱柳叶片的分类利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

春茶是一年中最优质的季节茶，谷雨前后的茶叶品质更好［21−22］，因此在2018年5月1日，从浙江省丽水市龙泉市朱章村（E118°48＇28＇＇，N28°5＇57＇＇）采集青钱柳叶片，幼叶指最小的完全展开的叶子，成熟叶指达到全叶大小和全叶厚度的叶子。从株高、冠径等长势相似，生长位置相近的三株植物中采集样本，产生了三个生物重复用于代谢组分析。所有样品收集后立即用液氮冷冻并储存在-80℃直至进一步分析。

1.2 代谢物提取

将氧化锆珠添加到冻干的叶子中，然后使用混合研磨机（MM400，Retsch，Haan，Germany）在30 Hz条件下粉碎1.5 min。称取粉末100 mg，加入1 mL 70%甲醇水溶液，4℃萃取过夜。萃取液以10，000×g离心 10 min 后，上清液提取物被吸收（CNWBONDCarbon GCB SPE Cartridge，250 mg，3 mL；ANPEL，中国上海）并过滤（SCAA-104，0.22µm孔径；ANPEL，中国上海），然后进行LC-MS分析。

1.3 质谱和色谱条件

采用超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）和串联质谱（Tandem mass spectrometry，MS/MS；Applied Biosystems 6500 QTRAP）进行LC-MS分析。使用以下分析条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8µm，2.1 mm×100 mm）；流动相：水相为超纯水（加入0.04%的乙酸），有机相为乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脱梯度：0 min 水/乙腈（95:5 V/V），11.0 min 为 5:95 V/V，12.0 min为 5:95 V/V，12.1 min为 95:5 V/V，15.0 min为95:5 V/V；流速0.4 mL/min；柱温40℃；进样量2µL。流出物交替连接到ESI-三重四极杆线性离子阱（Q TRAP）-MS。线性离子阱（LIT）和三重四极杆（QQQ）扫描是在配备 ESI Turbo离子喷雾接口的API 6500 Q TRAP LC/MS/MS系统的三重四极杆线性离子阱质谱仪（Q TRAP）上采集的，在正离子模式下运行并由Analyst 1.6软件（AB Sciex，Concord，Ontario，Canada）控制。质谱条件主要包括：电喷雾离子源温度500℃，质谱电压5500 V，帘气25 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。

1.4 数据分析

质谱数据由Analyst 1.6软件和MultiaQuant软件进行峰面积匹配和积分。使用R软件的prcomp函数和MetaboAnalystR函数进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。采用OPLS-DA模型得到的变量权重值（VIP）≥1，并结合单变量分析的差异倍数值（fold change）≥2或≤0.5来筛选差异表达代谢物。

2 结果与分析

2.1 幼嫩与成熟叶片代谢组学数据概况

对幼嫩叶片和成熟叶片的代谢组数据进行PCA分析，PCA得分如图1所示。由图1可知，在主成分1和主成分2维图上幼嫩叶片和成熟叶片之间有明显的分离趋势，表明两个样本之间的代谢物发生了明显变化。

图1 幼嫩叶和成熟叶样品的主成分分析得分图

通过火山图（如图2所示）可以快速地查看代谢物在两组样品中含量的差异，以及差异的统计学显著性。由图2可知，在两组样本之间共检测到695个代谢物，其中成熟叶片相比于幼嫩叶片共有94个代谢物含量显著上升，131个代谢物含量显著下降，470个代谢物在两组样品之间并无显著差异。其中变化最多的黄酮类化合物，其次为氨基酸及其衍生物，如表1所示。

图2 幼嫩叶和成熟叶样品数据火山图

表1 青钱柳幼嫩叶和成熟叶之间具有显著差异的代谢物数量

2.2 幼嫩与成熟叶片氨基酸组成比较

在幼嫩叶片和成熟叶片中共检测到12种具有显著差异表达的氨基酸，其中包括了苯丙氨酸和色氨酸两种人体必需氨基酸，如表2所示。12种氨基酸在幼嫩叶片中的表达含量均显著高于成熟叶片，其中精氨酸下调至原来的0.8%，瓜氨酸下调至原来的0.01%。

表2 幼嫩叶片和成熟叶片之间具有显著差异的氨基酸

2.3 幼嫩与成熟叶片黄酮类化合物组成比较

在幼嫩叶片和成熟叶片中共检测到45种具有显著差异表达的黄酮类化合物，如表3所示。在黄酮化合物中，12种化合物在幼嫩叶中的表达含量显著高于成熟叶片，7种化合物在成熟叶片中的表达含量显著高于幼嫩叶片。其中3′，4′，5′-二氢三羟黄酮O-二己糖苷、麦黄酮O-芥子酰己糖苷和樱花素仅在成熟叶中检测到，金圣草黄素5-O-己糖苷仅在幼嫩叶中检测到。在黄酮醇类化合物中，7种化合物在幼嫩叶片中的表达含量显著高于成熟叶片，7种化合物在成熟叶片中的表达含量显著高于幼嫩叶片，其中杨梅素和3-羟基黄酮仅在成熟叶片中检测到。在黄烷酮类化合物中，3种化合物在幼嫩叶片中的表达含量显著高于成熟叶片，3种化合物在成熟叶片中的表达含量显著高于幼嫩叶片，其中橙皮苷仅在成熟叶片中检测到。在黄烷醇类化合物中，1种化合物在幼嫩叶片中的表达含量显著高于成熟叶片，6种化合物在成熟叶片中的表达含量显著高于幼嫩叶片，其中没食子儿茶素-儿茶素仅在幼嫩叶片中检测到，表没食子酸儿茶素仅在成熟叶片中检测到。

表3 幼嫩叶片和成熟叶片之间具有显著差异的黄酮类化合物

2.4 幼嫩与成熟叶片有机酸及其衍生物组成比较

在幼嫩叶片和成熟叶片中共检测到16种具有显著差异表达的有机酸及其衍生物，如表4所示。11种化合物在幼嫩叶中的表达含量显著高于成熟叶片，5种化合物在成熟叶片中的表达含量显著高于幼嫩叶片。其中奎宁酸O-二葡萄糖醛酸仅在成熟叶片中检测到，苯乙醛酸仅在幼嫩叶片中检测到。

表4 幼嫩与成熟叶片之间具有显著差异的有机酸及其衍生物

3 讨论

茶叶中含有丰富的氨基酸，其组成类别和含量都会影响茶叶的品质［23］，此外在茶叶加工过程中氨基酸还可以转化为挥发性醛或其他产物，参与茶叶香气的形成［24］。本研究在青钱柳叶片中共检测到12种具有显著差异表达的氨基酸，且幼嫩叶片中的表达含量均显著高于成熟叶片，其中的苯丙氨酸、色氨酸不仅为人体必需氨基酸，还在茶叶滋味的协调中发挥着重要作用［25］141。在茶叶中发现并已鉴定了26种氨基酸，包括20种蛋白质氨基酸和6种非蛋白质氨基酸［14］。陈然等［26］分析检测了市售8大类29种茶叶的氨基酸组分，其中包含了青钱柳叶片中12种差异显著的氨基酸，其结果表明不同种类的茶叶具有不同的氨基酸组分及比例，青钱柳叶片中氨基酸组分及比例与市售茶叶具有相似性。茶叶在制作过程中氨基酸存在降解作用［25］146，因此采用高氨基酸含量的青钱柳幼嫩叶片所制得的茶叶可能具有更高的营养价值和更佳的茶汤滋味及香气。

青钱柳叶片中的黄酮类化合物具有降血脂、降血糖、降血压和提高免疫力的作用［27］。在日常饮食中，可以通过饮茶来摄取黄酮类化合物［28］，通过大数据调查分析，发现茶叶是日常饮食中黄烷-3-醇和黄酮醇的主要来源［29］。儿茶素类（黄烷醇类）、黄酮苷和黄酮醇苷不仅构成茶汤的独特风味，同时也是茶汤苦涩味的重要构成因子［30−31］。在本研究中，黄酮苷和黄酮醇苷中有5种化合物在幼嫩叶中含量显著高于成熟叶，12种化合物在成熟叶中含量显著高于幼嫩叶。儿茶素是茶叶保健功能的首要成分，具有抗氧化、抗癌、降血脂等作用，并且对茶叶的色、香、味品质形成也具有重要作用［28，32］。成熟叶中共有5种儿茶素类化合物含量显著高于幼嫩叶，1种化合物含量显著低于幼嫩叶。尽管黄酮类化合物具有多种有益活性，但是考虑到儿茶素类、黄酮苷和黄酮醇苷类化合物都是茶叶苦涩味的主要来源之一，因此具有高儿茶素类、黄酮苷和黄酮醇苷类化合物含量的成熟叶并不适宜开发为青钱柳茶叶，而适合用做原材料提取黄酮类化合物。

有机酸类化合物是青钱柳中重要功效类物质之一［33］，具有很强的抗氧化能力［34］。在本研究中，幼嫩叶中共有11种有机酸类化合物的表达含量显著高于成熟叶片，表明其营养价值更高。有机酸类化合物在冲泡过程中大多数都可被浸出到茶汤中，成为影响茶汤风味品质的主要成分之一［35］，例如，脂肪族有机酸对滋味的贡献较大，芳香族有机酸等是香气的主要成分［34］。含有丰富有机酸类化合物含量的幼嫩叶制得的茶叶相比于成熟叶可能具有更佳的口感和香气。

4 结语

本研究采用非靶向代谢组学方法，分析了青钱柳幼嫩叶片和成熟叶片之间的代谢物变化，共检测到695个代谢物，其中成熟叶片相比于幼嫩叶片共有94个代谢物含量显著上升，131个代谢物含量显著下降。这些代谢物对制得的茶叶的色、香、味品质形成以及营养价值均具有重要作用，幼嫩叶片适宜作为制作青钱柳茶的原材料，成熟叶片适宜作为工业生产上提取各类代谢物的原材料。