痰标本结核分枝杆菌DNA检测在结核病中的诊断价值

张文艳，陈珊

(1.鹤壁市传染病医院 检验科，河南 鹤壁 458000；2.鹤壁市人民医院 检验科，河南 鹤壁 458000)

结核病是由结核分枝杆菌通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，导致组织器官出现渗出性、增殖性或干酪样坏死性病变，临床以肺组织、支气管、气管及胸膜受侵的肺结核最常见。我国是结核大国，每年死于肺结核的患者近百万，居各种疾病死亡原因之首。早期诊断对结核病的治疗与预防传播具有重要意义。目前临床上常用痰培养、痰涂片检查，痰结核菌检查虽仍是肺结核的诊断金标准，但需要耗时6～8周，临床应用受到限制，因此，需要一种简便快捷且阳性率高的检查方法助力临床上结核的早期诊断。本研究通过对2020年1月1日至2020年9月11日于鹤壁市传染病医院诊治的95例肺结核患者的病历资料进行回顾性分析，探讨痰标本结核分枝杆菌DNA检测在结核病中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 基本资料选取2020年1月1日至2020年 9月11日于鹤壁市传染病医院诊治的95例肺结核患者的病历资料进行回顾性分析，其中男53例，女42例，年龄14～69岁，平均(38.83±7.12)岁。根据患者的痰涂片检查结果阳性、阴性将其分为初治涂阳组(46例)和初治涂阴组(49例)。另外选取47例经检验确认无结核病的健康者作为对照组，其中男26例，女21例，年龄15～67岁，平均(38.61±7.52)岁。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。肺结核患者、对照组患者年龄、性别等一般情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 纳入和排除标准(1)纳入标准：①初治涂阳组与初治涂阴组通过改良罗氏培养法及痰液涂片的检查并符合《WS 288-2017肺结核诊断中》[1]中关于肺结核的诊断标准；②对照组确诊无结核病；③患者及家属对研究知情并签署知情同意书。(2)排除标准：①病历资料缺失；②有恶性肿瘤、其他肺部疾病或其他传染性疾病；③精神疾病或认知障碍；④处于妊娠期或哺乳期；⑤中途退出研究。

1.3 研究方法

1.3.1分组前诊断性检验 (1)痰结核菌培养。将痰液用同体积40 g·L-1氢氧化钠处理0.5 h，取0.1 mL痰液接种至酸性罗氏培养基中，菌落生长后进行抗原检测、涂片抗酸染色及生长试验鉴定菌种，严格按照试剂盒说明书进行规范操作，培养8周后判读结果，对照培养基生长良好，含药培养基的菌落生长数多于20个即判定为耐药。(2)痰涂片。将痰液标本直接涂布于载玻片上，固定之后进行染色，用显微镜观察痰液中是否含有结核分枝杆菌。

1.3.2T细胞斑点试验(T-SPOT.TB) 阴性为斑点数量0～5个；阳性为抗原A与抗原B检测孔数量减去阴性孔数量≥6。

1.3.3结核分支杆菌DNA检测 (1)痰液标本的采集。使用双盲实验法采集所有患者的痰液标本，采集痰样本前用清水漱口，收集当天早中晚3次深处咳出痰液，装于无菌痰杯中加盖封闭送检[2]。注意注明标签，不要弄混。(2)聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)法[3]。选择中山大学达安基因股份有限公司生产的结核分支杆菌DNA检测试剂盒，严格按照说明书进行检测操作。把同等剂量的40 g·L-1NaOH消化液和痰液标本放入无菌瓶内摇匀后静置30 min备用，取1 mL置于离心管中离心3 min(12 000 r·min-1)，弃去上清液，加入核酸提取液静置10 min后置于DNA提取管内，在DNA提取仪中离心3 min，取上清液2 μL置入PCR反应管，上机检测。采用荧光检测扩增，扩增操作按说明书规范进行，检测及结果判断严格按说明书进行，记录扩增期间荧光强度，分析增长曲线，结合循环阈值计算结核杆菌DNA含量，若循环阈值<30且扩增曲线呈S形，说明结核分枝杆菌阳性[4-5]。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件进行统计处理，阳性检出率、敏感性等定性资料以频数和百分比(%)表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌DNA检测结果与T-SPOT.TB检测结果初治涂阳组、初治涂阴组的荧光定量PCR法阳性检出率均高于T-SPOT.TB法，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组患者荧光定量PCR法与T-SPOT.TB检查结果比较(n，%)

2.2 初治涂阳组、初治涂阴组患者检测结果的特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值分析两组荧光定量PCR检测的特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值均高于T-SPOT.TB法。见表2。

表2 两组患者检测结果特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值分析(%)

3 讨论

我国作为结核大国，对结核病及其病原体的研究不断开展，临床经验丰富，尤其是全国普及接种卡介苗后，结核病的发病率和病死率得到了控制，但仍远远高于其他传染性疾病，尤其是因为缺少新型抗结核药物、某些地区药物的不规范使用导致肺结核病的耐药性越发严重，在部分低收入地区及发展中国家结核病发病率仍呈增长趋势[6-7]。如果得不到及时有效的治疗会造成呼吸系统损伤，还会并发肺心病、肺癌等严重疾病，患者可能出现肺功能下降、免疫力低下、心肺功能不全等严重并发症，不仅严重影响患者生活质量及生命安全，因其传染性较强，还会带来公共卫生安全隐患。目前临床常用的痰结核菌培养法准确率较低、痰涂片抗酸染色法耗时过长，都存在一定的缺陷[8]。因此，需要探寻高准确度、高效率且能在临床中广泛普及的检验方法推动结核病的早期诊断，对结核病患者的规范治疗和地区传染病的预防控制具有重要意义。

本研究结果显示，初治涂阳组、初治涂阴组的荧光定量PCR法阳性检出率均高于T-SPOT.TB法，两组应用荧光定量PCR的特异性、敏感性、阳性预测值、阴性预测值均高于使用T-SPOT.TB法。PCR荧光定量法是通过荧光染料进行特异性标记的探针，对PCR产物进行标记跟踪的较新型的定量试验技术，可以实时监测目标反应过程，使用相应的软件对产物进行分析，被广泛应用于肝炎、结核病、艾滋病、禽流感等多种传染性疾病的临床诊断。荧光定量PCR法极大地简化了目标定量检测的过程，而且实现了绝对定量和自动化操作，可较准确地分析结核分枝杆菌DNA含量，精准度高、操作简单、工作效率高且结果清晰，因此，应用于肺结核患者痰标本结核分枝杆菌DNA检测中结果灵敏度和阳性检出率均较高[9]。

综上所述，使用荧光定量PCR法检验痰标本中的结核分枝杆菌DNA的阳性检出率、阳性预测值、检测敏感性及特异性都较高，可对疑似肺结核患者进行快速无创的早期诊断，提高了肺结核的临床诊断效能和准确度，降低了肺结核误诊患者进一步传播病原体的可能性，值得在临床中广泛应用。