PTEN基因在NF-κB信号通路介导的肺纤维化中的作用

吴志伟，纪焕文，闫筱新

(郑州大学附属郑州中心医院 内科，河南 郑州 450007)

随着人口老龄化的不断加速以及工业化的快速发展，空气质量明显变差，临床肺脏疾病患者数量明显增多[1]。肺纤维化是多种肺脏疾病发展到终末期的病变，主要表现为成纤维细胞大量增生，肺长皮细胞组织炎症损伤、结构破坏等[2]。肺纤维化对人体呼吸功能以及肺功能损害严重，死亡率甚至超过许多肿瘤类疾病。目前临床关于肺纤维化发病机制的研究较多，但结论差异较大。PTEN基因具备磷酸酯酶的活性，已有大量临床研究表明，PTEN能够通过拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性起到抑制肿瘤细胞生长、侵袭作用[3]。而近年来，有研究发现PTEN基因可能参与了肺纤维化的发生发展[4]。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)存在于几乎所用动物细胞中，在细胞炎症以及免疫反应中发挥重要作用，其异常表达可引发机体发生多种炎症、免疫或肿瘤类疾病[5]。有研究表明，PTEN基因可能通过P13K/Akt信号调控NF-κB基因的表达[6]，但尚未明确这一过程是否与肺纤维化的发生有关。本研究通过制备大鼠模型，旨在探讨下调PTEN基因是否能够通过NF-κB介导肺泡上皮细胞衰老参与肺纤维化发病。

1 材料和方法

1.1 动物的选取清洁级健康雄性SD大鼠210只，8～10周，体质量(175.48±5.36)g，购买于南京卡尔文。标准饲料喂养，适当饮水，适当光照，饲养7 d后投入实验。

1.2 动物分组与实验方法

1.2.1分组及给药 将60只SD大鼠随机分为A、B两组，每组30只。将PTEN inhibitor溶于人工脑脊液(上海信帆生物)，浓度20 μmol·L-1，给予B组大鼠PTEN inhibitor侧脑室注射，共注射6 μL，速度为1 μL·min-1，A组大鼠只接受人工脑脊液注射。

1.2.2PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA水平检测 (1)PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA以及内参U6的引物序列表U6引物(上海生工生物工程公司)。(2)PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA在大鼠肺上皮细胞的表达用RT-PCR技术进行检测，严格根据说明书进行操作，用Trizol提取细胞中的总RNA。使用逆转录酶和寡核苷酸按照操作说明书合成cRNA。转录反应体系(20 μL)：缓冲液4 μL，逆转录酶2 μL，总RNA 2 μL，去RNA酶水12 μL；反应条件：42 ℃水浴1 h，95 ℃水浴5 min；使用PCR仪进行扩增反应，以RNU6B作为内参对照，根据操作说明书使用MiR-29c、Birc2及Bak1的特异引物在荧光定量PCR仪中进行检测PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA的表达。PCR反应体系(20 μL)：上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、mir 0.5 μL，其余用ddH2O补齐反应体系，实时PCR的条件为：94 ℃ 10 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 30 s退火，72 ℃ 15 s，然后40个循环。每次实验设置3个复孔，实验重复3次，实验结果使用相对定量法分析。见表1。

表1 PTEN mRNA、NF-κB mRNA、P16 mRNA、P21 mRNA以及内参U6的引物序列

1.2.3PTEN蛋白、NF-κB蛋白、P16蛋白、P21蛋白水平检测 采用Western Blot法对大鼠处死后的肺上皮细胞的PTEN蛋白、NF-κB蛋白、P16蛋白、P21蛋白水平进行检测，检测步骤如下：取大鼠缺血侧脑组织标本，匀浆器充分研磨后加入裂解液裂解并提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。根据目标蛋白大小配置适合浓度的凝胶、分离胶和浓缩胶。电泳加压转膜后脱脂奶粉封闭1 h。加入特异性PTEN、NF-κB、P16、P21抗体，稀释比例为1∶1 000，以β-actin(1∶5 000)作为对照。去除一抗，洗涤后加入二抗，室温孵育2 h，漂洗，化学发光法X片显影，采用Image J软件得到条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.2.4肺上皮细胞凋亡情况 采集死后大鼠肺上皮细胞，置于500 μL的结合缓冲液，用5 μL的FITC-Annexin V试剂(BestBio-贝博生物)和碘化丙啶(美仑生物)双标记凋亡细胞30 min。在1 h内采用FACSCalibur流式细胞仪(美国BD Bioscience)对细胞进行分析。以Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+象限的凋亡细胞百分率表示凋亡率。每个样本重复3次。

1.2.5大鼠肺组织HE染色 将脱蜡至水的大鼠肺组织切片放入苏木精水溶液中染色数分钟；将切片放入酸水及氨水中分色，5～8 s；流水冲洗1 h后入蒸馏水片刻；在体积分数为70%和90%酒精中脱水各10 min；酒精伊红染色液染色2～3 min；染色后的切片经纯潘精脱水，经二甲苯使切片透明；将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。所有HE染色液均购买于北京索莱宝科技有限公司。

1.3 观察指标(1)大鼠的PTEN、NF-κB、P16、P21mRNA水平；(2)大鼠的PTEN、NF-κB、P16、P21蛋白水平；(3)PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA之间的相关性；(4)大鼠肺上皮细胞凋亡率；(5)大鼠肺组织染色结果。

2 结果

2.1PTENmRNA、NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA水平与A组大鼠相比，B组大鼠的PTENmRNA水平偏低，而NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA水平均偏高，差异有统计学意义(P<0.05)。降低NF-κBmRNA可能通过激活NF-κBmRNA促进衰老基因P16mRNA、P21mRNA水平升高。见表2。

表2 两组大鼠的PTEN、NF-κB、P16、P21 mRNA水平比较

2.2 PTEN蛋白、NF-κB蛋白、P16蛋白、P21蛋白水平与A组大鼠相比，B组大鼠的PTEN蛋白水平偏低，而NF-κB蛋白、P16蛋白、P21蛋白水平均偏高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组大鼠的PTEN、NF-κB、P16、P21蛋白水平比较

2.3 相关性分析logistic分析结果显示，PTENmRNA与NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA均呈负相关(r=-0.624、-0.637、-0.598，P<0.05)，NF-κBmRNA与P16mRNA、P21mRNA均呈正相关(r=0.631、0.628，P<0.05)。

2.4 肺上皮细胞凋亡率流式细胞检测结果显示，A组大鼠肺上皮细胞凋亡率为(4.62±0.49)%，B组大鼠的肺上皮细胞凋亡率为(26.47±1.85)%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 HE染色结果HE染色结果显示，B组大鼠肺纤维断裂、重排及变性坏死情况严重，细胞间隙明显变宽，肺上皮细胞排列杂乱，肺上皮细胞炎症细胞浸润严重；A组大鼠肺上皮细胞无明显损坏，排列较为整齐，形基本正常，炎症细胞浸润较少，肺纤维无明显断裂、重排及变性坏死。

3 讨论

肺纤维化是多种间质性肺疾病发展到终末期肺脏表现之一。已有临床研究表明，肺上皮细胞衰老参与了肺纤维化发生发展过程[7]。如何减少肺上皮细胞衰老，抑制肺纤维化发展已成为临床研究热点问题。PTEN是机体内较为常见的抑癌基因，而NF-κB则为一种机体内较为主要的炎症介质，两者均已被证实与肺纤维化的发生发展密切相关[8-9]。本文旨在探讨PTEN基因缺失是否能够激活NF-κB介导肺泡上皮细胞衰老参与肺纤维化发病。

本研究对两组大鼠造模后肺上皮细胞组织的PTEN、NF-κB、P16、P21mRNA及其蛋白水平进行了比较，结果显示，大鼠经PTEN inhibitor人工脑脊液注射，其PTEN蛋白及mRNA水平上升，而NF-κB、P16、P21蛋白及mRNA均下降，并且PTENmRNA与NF-κBmRNA、P16mRNA、P21mRNA均呈负相关，而NF-κBmRNA与P16mRNA、P21mRNA均呈正相关。B组大鼠PTEN蛋白及mRNA水平的上升说明了本次造模的成功性。P16、P21均为机体内较为主要的衰老基因，其表达水平能够在一定程度上反映细胞衰老和凋亡速度[10]。本研究结果中B组大鼠肺上皮细胞组织P16、P21表达明显升高，说明其肺上皮细胞衰老速度明显加快。NF-κB参与了机体内多种细胞的增殖、侵袭和凋亡、衰老过程，Mou等[11]在研究中发现，NF-κB还能够调节细胞衰老速度，NF-κB在衰老细胞组织中的表达明显上调。You等[12]研究显示，NF-κB在衰老疾病患者体内表达异常偏高，如老年痴呆、动脉硬化、肝硬化等。PTEN是定位于染色体10q23.3，编码由403个氨基酸组成的蛋白质，已有临床研究表明PTEN与肺纤维化的发生有关。Bo等[6]研究发现，PTEN能够通过P13K/Akt信号负性调控NF-κB的表达，这与本研究结果一致。因此，本研究中，降低PTEN基因可能通过激活NF-κB调高大鼠肺上皮组织P16、P21的表达水平，并促进肺上皮细胞衰老。

流式细胞检测结果显示，B组大鼠肺上皮细胞凋亡率高于A组，而HE染色结果表明，B组大鼠已经出现较为明显的肺纤维化，A组大鼠肺组织未遭受明显破坏，这表明调低PTEN基因可能通过负向调控NF-κB促进肺大鼠上皮细胞凋亡，并导致大鼠肺纤维化的发生发展。Xie等[13]研究发现，NF-κB作为机体内较为主要的炎症信号通路，具备明显的促肺上皮细胞凋亡作用，抑制其表达有利于减少肺上皮细胞凋亡，并改善机体肺纤维化病情。Li等[14]研究结果显示，乌司他丁药物可通过降低机体内NF-κB、TNF-β1以及TNF-α表达水平改善肺纤维化患者病情预后，NF-κB是参与肺纤维化病情发生发展的重要炎症细胞因子之一。Qiu等[15]研究显示，PTEN作为一种抑癌基因，其水平降低表明可直接通过加速肺上皮细胞衰老，促进肺纤维化发生发展，又可以通过P13K/Akt信号负性调控NF-κB基因的表达水平而促进肺纤维化病情发生演变，这与本研究结果一致。因此，本研究结果中，调低大鼠PTEN基因表达，可能通过激活NF-κB促进肺大鼠上皮细胞凋亡，并促进大鼠肺纤维化。

综上所述，PTEN基因缺失可能通过激活NF-κB介导大鼠肺泡上皮细胞衰老，并导致肺纤维化病情发生。本研究尚存在一些不足之处，例如本研究仅进行了动物实验，说服力有限，今后的研究可增设人体肺组织细胞转染环节，以便于进一步探讨PTEN基因缺失是否能够通过激活NF-κB介导肺泡上皮细胞衰老，并导致人体肺纤维化病情的发生发展。