苗药透骨香的抗氧化活性研究及总黄酮、总酚酸的含量测定*

高秀印，李金金，肖 婷，郭正红，谢树才，刘红云

(1 贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2 贵州医科大学,贵州 贵阳 550025)

苗药透骨香，又名滇白珠，是我国西南苗族、白族、彝族、瑶族等九个少数民族的常用药物，为杜鹃花科(Ericaceae)白珠树属(GaultheriaKalm ex Linn.)植物透骨香(G.yunnanensis)的根或全草。具有清热解毒、活血化瘀、祛风除湿、顺气平喘的功效，临床主要用于治疗类风湿性关节炎(RA)[1-2]，《贵阳民间药草》主述其治风湿关节疼痛，跌打损伤，在《贵州草药》中记载其可祛风除湿，舒筋活血，配伍车前草、川乌、草乌等药，用于风湿性关节炎、筋骨拘挛等症的治疗。

研究表明氧化应激在 RA的发病及病理过程中影响颇大[3]，当机体组织的自由基过度产生或者抗氧化防御体系功能受损时，体外抗氧化剂的补充可以提高机体提升抗氧化和抗炎能力，减少细胞凋亡和氧化损伤。本实验基于酶标仪-微孔板，采用 1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基清除法、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基清除法、铁离子还原法(FRAP)测定透骨香各萃取层的自由基清除能力和总抗氧化能力，采用福林酚法和Al(NO3)3-NaNO2-NaOH 显色法分别测定其中多酚和总黄酮含量，为透骨香在临床上治疗 RA提供科学依据。

1 材 料

1.1 药材与试剂

药材于2019年9月在贵阳太湖升中药材市场购得，由贵州中医药大学药学院魏升华教授鉴定为透骨香(G.yunnanensis(Franch.)Rehd)的干燥根。将透骨香的根(5.00 kg)切碎用 8 倍量的 75%乙醇水浴回流提取3次，每次2小时，经浓缩得到干浸膏(513.02 g)，浸膏用水分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，减压浓缩，分别得到石油醚层浸膏(3.68 g)、二氯甲烷层浸膏(33.51 g)、乙酸乙酯层浸膏(20.46 g)、正丁醇层浸膏(192.52 g)和水层浸膏(209.38 g)。

供试液的配置：取适量样品75%乙醇溶解，充分震荡使其完全溶解，配制成10 mg/mL供试品溶液，然后稀释成5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL 和0.1 mg/mL的浓度梯度的供试品溶液。

阳性对照药VC取适量样品 75%乙醇充分溶解，配制成 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL和0.1 mg/mL的梯度浓度。

没食子酸标准品(95%，110631-201605)，中国食品药品检定研究所；VC(20200649)，华中药业股份有限公司；芦丁标准品(92.5%，100080-200707)，中国食品药品检定所；TPTZ(BCCD2024)，ABTS(SlBZ8095)，DPPH(MKCN0676)西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；K2S2O8(20200120)，优耐德引发剂合肥有限公司；FeCl3·6H2O(20180301)，国药集团化学试剂有限公司；NaCO3(20200416)，天津市科密欧化学试剂有限公司；NaNO2(20201012)，国药集团化学试剂有限公司；FeSO4·7H2O(20200313)，国药集团化学试剂有限公司；CH3COONa(20200220)，国药集团化学试剂有限公司；福林酚(S15D11J134401)，源叶生物；Al(NO3)3，天津市瑞金特化学品有限公司。

1.2 仪 器

酶标仪(1530)，Life Technologies Holding Pte Ltd；UV-5900紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；BS110S 电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司。

2 方法与结果

2.1 DPPH·清除能力的测定

2.1.1 实验方法[4]

准确称取3.94 mg DPPH用甲醇溶解，并定溶于10 mL棕色容量瓶中，避光，0～4℃条件下保存备用。样品组配制：取10 μL不同浓度的各萃取层溶液，然后加入80 μL DPPH溶液，混合后在室温下避光反应30 min，在517 nm处测其吸光度Ai；对照组：与样品组相比，80 μL DPPH溶液更换为80 μL的甲醇溶液，其余相同，其吸光度为Aj；空白组：与样品组相比，10 μL不同浓度的各萃取层溶液更换为10 μL的75%乙醇溶液，其余相同，其吸光度为A0。每个样品设置3个重复孔。用DPPH 自由基清除效率评价公式计算EC50值：

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

2.1.2 实验结果

透骨香各萃取层对 DPPH·清除能力如图1a所示。各萃取层的清除能力不同，其中乙酸乙酯层的清除能力最强，水层的清除能力最弱，其清除能力由高到低为：乙酸乙酯层>正丁醇层>二氯甲烷层>石油醚层>水层。各萃取层层的 EC50(mg/mL)分别为：乙酸乙酯层 7.17、正丁醇层18.90、二氯甲烷层 113.32、水层 249.02和石油醚层 494.63。阳性药VC的EC50为 1.69。结果表明透骨香乙酸乙酯层对 DPPH·具有较好的清除能力。

2.2 ABTS·清除能力的测定

2.2.1 实验方法[5]

ABTS工作液的配制：精密称取 ABTS 38.41 mg，加蒸馏水稀释至 10 mL；称取 K2S2O866.10 mg，加蒸馏水稀释至 100 mL；然后将 ABTS 溶液与K2S2O8溶液等体积混合，避光贮存 12～16 h，最后将生成的ABTS·+储备液用蒸馏水稀释，得到 ABTS 工作液。

样品组：于 96 孔酶标板中分别加入各萃取层不同浓度的样品溶液 10 μL，加入 ABTS 工作液 100 μL，振摇混匀10 s后在 37 ℃下反应 6 min，于 734 nm 处测定吸光度，记为 A1； 空白组：以 75%乙醇代替样品溶液，其余同样品组一样，测得空白吸光度，记为 A0；以 VC 为阳性药。每个样品设置 3 个重复孔。计算各样品对 ABTS 自由基的清除率，并计算EC50的值。

ABTS 自由基清除率=(A0-A1)/A0×100%

2.2.2 实验结果

透骨香各萃取层对 ABTS·清除能力如图1b所示。与对 DPPH·清除能力类似，透骨香根的各萃取层的清除能力由高到低为：乙酸乙酯层>正丁醇层>二氯甲烷层>石油醚层>水层。各萃取层层的 EC50(mg/mL)分别为：乙酸乙酯层 0.98、正丁醇层 4.22、二氯甲烷层 14.75、石油醚层 27.39和水层 69.95，阳性药VC的EC50为 0.28。从结果可以看出，透骨香乙酸乙酯层对 ABTS·具有较好的清除能力。

2.3 FRAP法对透骨香各萃取层总还原能力的测定

2.3.1 实验方法[6]

FRAP工作液的配制：将2.5 mL 300 mmoL/L醋酸一醋酸钠缓冲液(pH 3.6)，250 μL 10 mmoL/L TPTZ溶液与250 μL 20 mmoL/L FeC13溶液混匀，备用。

FeSO4·7H2O标准曲线的绘制：精密称取 4.17 mg 定容在 10 mL 的容量瓶中，吸取 5 mL 向 10 mL 的容量瓶中定容后则配制成11.72 μmol/L、23.44 μmol/L、46.875 μmol/L、93.75 μmol/L、187.5 μmol/L的FeSO4溶液，依次吸取 160 μL FeSO4溶液于 96 孔酶标板中，吸取FRAP工作液200 μL加入96孔酶标板中，放入酶标仪内，升温至37 ℃，于593 nm下读取吸光值A，以 FeSO4溶液浓度为横坐标，A为横坐标纵制标曲，得回归方程Y=0.0116X+0.0909(R2=0.9997)。

吸取FRAP工作液150 μL加入96孔酶标板中之后在孔中加入10 μL 75%乙醇做空白对照，放入酶标仪内，升温至37 ℃，10 min后于593 nm下读取吸光值 A反应前。吸取FRAP工作液150 μL加入96孔酶标板中之后在孔中加入 10 μL 5 mg/mL的待测样品，升温至37 ℃，10 min后于593 nm处读取吸光值A反应后。以 0.5 mg/mL的 VC为阳性对照药。由A反应后-A反应前的差值在标准曲线上获得抗氧化物质相应的FeSO4的浓度(μmoL/L)，定义为FRAP值。

2.3.2 实验结果

透骨香各层的抗氧化活性见图1c，VC的抗氧化活性最强为181.67，其次为透骨香的乙酸乙酯层105.55>正丁醇层91.07>二氯甲烷层58.08>石油醚层31.93>水层8.74。

图1 各萃取层自由基清除和总抗氧化能力

2.4 总黄酮含量的测定

2.4.1 实验方法[7]

芦丁标准曲线的绘制：精确称量芦丁对照品 10.50 mg置于25 mL量瓶中，75%乙醇溶液溶解，定容摇匀，得 0.42 mg/mL标准溶液。精确吸取标准溶液配制成 0、0.0084、0.0168、0.0252、0.0336、0.0042 mg/mL 的对照品溶液，分别加入 0.3 mL 5% NaNO2，摇匀后静置6 min，再加入 0.3 mL 10% Al(NO3)3，摇匀后静置 6 min，加入 4 mL 4% NaOH溶液，蒸馏水定容，摇匀后静置 15 min，在 510 nm处分别测量吸光值。以芦丁浓度(X，mg/mL)和吸光值(Y)进行绘制标准曲线，得到标准曲线：Y=12.554X+0.0004(R2=0.9991)。

取各萃取层溶液1 mL，分别加入0.3 mL 5% NaNO2，摇匀后静置5 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，摇匀后静置 6 min，加入蒸馏水定容，摇匀后静置15 min，在510 nm处分别测量吸光值，采用标准曲线法计算各各萃取层含有的总黄酮含量(以芦丁计)。

2.4.2 实验结果

结果表明苗药透骨香中不同萃取部位中含有的总黄酮量存在显著差异，如表1所示。其中乙酸乙酯层最高 875.04 mg/g，正丁醇层次之 413.57 mg/g、二氯甲烷层 118.75 mg/g、石油醚层 107.63 mg/g、水层最低 43.11 mg/g。

表1 各萃取层中总黄酮和总酚酸的含量(n=3)

2.5 总酚酸含量的测定

2.5.1 实验方法[8]

南齐谢赫有云：“画有六法，一曰气韵生动，二曰骨法用笔，三曰应物象形，四曰随类赋彩，五曰经营位置，六曰传移模写。”罗春辉的现代工笔绘画作品本着《周易·系辞》“观物其象”“立象以尽意”之说，以重彩、没骨入画既能“笔墨积微”，又能高扬色彩，“工”能勾勒立象，细致精雅，“写”能“惚兮恍兮，其中有象；恍兮惚兮，其中有物；窃兮冥兮，其中有精，其精甚真”。他是对“六法”说进行一个全新的诠释。凭借对传统的守正和超然，凭借作画时的情之深、意之切和趣之足，凭借明丽典雅、磅礴杳渺的画境和神遇迹化，超然象外的盎然意趣，罗春辉的现代工笔绘画艺术必将如俨俨高松超拔于当代工笔画坛，成为艺术创作的新典范和勇于创新的新表率。

没食子酸标准曲线的绘制：精密称取 10.0 mg没食子酸对照品，加蒸馏水定容至 100 mL，得没食子酸对照溶液。取适量对照品溶液，配制成浓度分别为 0、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL浓度对照品溶液，取 2 mL 的对照品溶液，精密加入0.5 mL福林酚试剂，摇匀，再精密加入 2 mL 10% NaCO3溶液，摇匀，蒸馏水定溶至 10 mL，75 ℃水浴 10 min，冷却至室温，测定750 nm处吸光度。以没食子酸浓度C为横坐标、没食子酸对照溶液的吸光度A为纵坐标绘制标准曲线：Y=1.61.51X-0.0071(R2=0.9991)。

取2 mL的各萃取层溶液，精密加入 0.5 mL 福林酚试剂，摇匀，再精密加入 2 mL 10% NaCO3溶液，摇匀，蒸馏水定溶至 10 mL，75 ℃水浴 10 min，冷却至室温，测定 750 nm处吸光度，采用标准曲线法计算各各萃取层含有的总酚酸含量(以没食子酸计)。

2.5.2 实验结果

结果表明，苗药透骨香各萃取层总多酚含量存在显著差异，如表所示。其中乙酸乙酯层含量最多高，达 228.50 mg/g、正丁醇层 98.50 mg/g、二氯甲烷层 32.10 mg/g、石油醚层42.09 mg/g、水层21.85 mg/g。

3 讨 论

目前体外抗氧化活性评价方法主要有自由基清除实验，脂质过氧化抑制实验和总抗氧化能力的测定等评价方法，其中 DPPH 自由基清除实验、ABTS 自由基清除实验和 FRAP是最常用的三种方法[9]。其中 DPPH自由基N原子上有单电子， 517 nm为 DPPH 自由基的最大吸收波长，DPPH 在醇溶液中颜色为紫色，当存在自由基清除剂时，DPPH自由基单电子配对而使其颜色褪去，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系。ABTS可被氧化剂氧化，生成蓝绿色的自由基阳离子 ABTS·+，在734 nm 处有最大吸收，ABTS·+在抗氧化剂存在下，与之反应生成 ABTS，颜色消失。通过测量ABTS·+在反应前后734 nm 处吸光度的变化测量可以计算样品的自由基清除能力。FRAP 是在酸性条件下测定样品的总抗氧化能力，该方法广泛应用于医药和食品领域。Fe3+与三吡啶三吖嗪(TPTZ)形成螯合物，在酸性条件下 Fe3+可被样品中的还原物质还原为Fe2+而呈现蓝色，并在 593 nm处有有最大吸收，根据反应前后吸光度的差值来计算样品中抗氧化能力的强弱。

透骨香不同萃取层的自由基清除活性和抗氧化活性活性与其所含的化学成分密切相关，黄酮类化合物和酚酸类化合物具有较强的自由基清除活性和抗氧化活性，因此本实验对不同萃取层中的总黄酮和总酚酸类成分进行了测定。

总酚酸测定的方法有铁氰化钾-三氯化铁反应、福林酚法、HPLC法、分光光度法、羧甲基纤维素沉淀法等。由于紫外分光光度法的易用性，是测定酚类化合物应用最多的方法。分光光度法测定总酚酸主要的包括两种方法：福林酚法(Folin-Ciocalteau)和总酚类指数(TPI)，其中 Folin-Ciocalteau 法是运用最多的方法[11-12]。其原理是酚酸类化合物的酚羟基在碱性溶液中可以被钨钼酸定量氧化，钨钼酸(W6+)则被还原成蓝色的(W5+)，颜色的深浅与酚酸的含量成正比。

4 结 论

从实验结果可以看出，三种方法测定透骨香不同萃取层的自由基清除活性和总抗氧化能力具有一致性，其中乙酸乙酯萃取层的自由基清除活性和总抗氧化能力最强，其次为二氯甲烷层和正丁醇层，石油醚层和水层的活性较弱。但在 DPPH 和 ABTS 实验中，石油醚层和水层的活性顺序略有差别。乙酸乙酯萃取层的总黄酮含量最高，为875.04 mg/g，其次为正丁醇萃取层，为413.57 mg/g，从文献报道来看，透骨香中的黄酮多为糖苷类化合物，苷元较少，与实验结果基本一致。乙酸乙酯萃取层总酚酸含量最高，为228.50 mg/g，其次是正丁醇层，为98.50 mg/g。文献调研发现，透骨香中酚酸类成分多为水杨酸甲酯及其衍生物和苯丙烯酸类化合物及其衍生物，该类成分主要存在乙酸乙酯和正丁醇层中，实验结果也与文献调研结果基本一致。

综上所述本实验采用DPPH、ABTS和FRAP 法对透骨香的抗氧化活性进行了整体评价，并对抗氧化活性较好的总黄酮和总酚酸的含量进行了分析，为苗药透骨香的进一步深度开发、综合利用与优化提供了理论依据。