人源抗体转基因动物平台及专利保护

吴 梦， 邹贤刚， 刘作华， 杨松全， 葛良鹏,4

(1. 重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2. 农业部养猪科学重点实验室，重庆 402460；3.养猪科学重庆市市级重点实验室，重庆 402460；4. 重庆市医用动物资源开发与转化应用工程技术中心，重庆 402460；5. 重庆金迈博生物科技有限公司，重庆 402460)

抗体药物是人类医学史上重大发明之一，在重大疾病治疗和生物安全防控方面发挥着重要的作用。作为开发全人抗体的核心工具动物，人源抗体转基因动物平台在抗体药物研发过程中有着重要的作用，因此对人源抗体动物的培育及其核心专利的保护尤为重要。本文重点介绍了几种常用人源抗体转基因动物品系以及它们的核心专利保护，并对其应用和发展趋势进行了分析和展望。

1 治疗性抗体药物的人源化程度和基本类型

抗体药物的发展经历了鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体等不同发展阶段(图1)，其人源化程度和质量随科学发展不断提高，全人抗体是由人类免疫球蛋白基因DNA(deoxyribo nucleic acid, 脱氧核糖核酸)表达产生，因此其安全性、有效性较之前的抗体药物进一步提升，是当前和未来抗体药物发展的重点[1-2]。

抗体模拟图：绿色表示鼠抗体，红色表示人抗体，黄线表示鼠CDR区，蓝线表示人CDR区。图1 抗体药物的发展历程和抗体药物的类型Figure 1 Development and format of therapeutic antibody drugs

人源抗体转基因动物是开发全人抗体的主流技术之一，截至2020年10月，美国食品药品监督管理局(FDA)累计批准32个全人抗体药物，其中23个(约72%)是由人源抗体转基因小鼠平台开发而来(表1)，余下的9个(28%)来源于噬菌体展示平台。一般来说，噬菌体展示技术是“先快后慢”，即找到特异性的抗体速度较快，但得到的抗体往往亲和力不高，需要进行氨基酸突变来提高亲和力；然而优化会有改变抗体空间结构的风险，导致抗体活性丢失，且在优化的过程中也会带来免疫排斥的风险。人源抗体转基因动物技术则是“先慢后快”，即抗原免疫小鼠、产生特异抗体、杂交瘤融合和筛选等步骤可能需要几个月的时间，但由于抗体的产生过程是在小鼠体内完成，容易筛选获得高亲和力的候选抗体同时由于经过动物体内的自然筛选，留下的抗体综合性能更为优异。Jain等[3]对已经批准上市和正在开展临床研究的全人抗体做了全面分析，结果显示：人源抗体转基因动物平台与噬菌体展示技术相比，利用人源抗体转基因动物平台开发的全人抗体药物具有更好的成药性。

表1 FDA已批准上市全人抗体药物及其来源的人源抗体转基因动物平台

2 人源抗体转基因动物平台

人源抗体转基因动物培育的基本技术路线是将人的部分、全部或者经过修饰后的免疫球蛋白基因转入到动物体内，从而代替动物内源性抗体的表达。其可以通过以下两个转基因技术方案来完成：一是在敲除动物内源免疫球蛋白基因的关键基因片段的基础上，将人的免疫球蛋白基因随机插入(或者同源插入)到动物的基因组上；二是用人的免疫球蛋白基因片段[V(variable)、D(diversity)、J(joining)]原位置换动物内源的免疫球蛋白基因片段(V-、D-、J-)，采用动物内源的C区(constant region)和调控元件，实现人的免疫球蛋白基因在小鼠体内的表达。但是，由于编码人抗体的免疫球蛋白基因片段超大，结构复杂，特别是免疫球蛋白基因的许多DNA序列的功能还不清楚，抗体表达调控机制复杂，因此，培育人源抗体转基因动物的技术难度巨大，同时还要考虑已有的人源抗体转基因动物平台相关专利保护[4-6]。

人源抗体转基因动物的培育经历了不同的发展阶段。第一代人源抗体转基因动物是将部分人源抗体重链和κ和/或λ轻链转入动物体内，同时敲除动物内源的免疫球蛋白重链、κ轻链和/或λ轻链，其代表为Lonberg博士和Larry Green博士两个团队分别培育出的HuMAb©小鼠和XenoMouse©小鼠[7-8]；第二代人源抗体转基因动物在第一代基础上，实现了完整人源免疫球蛋白基因的稳定转入，使人源抗体重排多样性得到了保障，其代表为日本麒麟公司培育的TCTMMouse小鼠[9]；第三代人源抗体抗体转基因动物又在第二代的基础上，重点解决人源抗体动物B细胞发育和免疫性能问题，其技术原理是通过保留宿主动物免疫球蛋白重链的C区或利用B细胞时空特异性表达技术，解决BCR结构的适配性问题，使B细胞的分化、抗体类型转换正常，其代表为KyMouseTM小鼠、VelocImmune©Mouse小鼠和CAMouse©小鼠等[10-12]。目前全球成功培育的主要人源抗体转基因动物平台见表2。

表2 主要的人源抗体转基因动物平台

2.1 XenoMouse©小鼠平台

XenoMouse©小鼠平台最初由Cell Genesys公司Larry Green博士牵头培育获得。1996年XenoMouse©小鼠平台从Cell Genesys独立出来成为Abgenix公司，2005年底，Amgen公司以22亿美元的价格收购了Abgenix公司。目前利用该平台已成功开发了8个上市抗体药物(表2)。该小鼠携带有大部分人的重链(heavy chain)和κ轻链(kappa light chain)免疫球蛋白基因序列，包括17个重链VH(variable heavy region)和18个轻链VK(variable kappa region)。同时敲除了小鼠自身的重链和κ轻链免疫球蛋白基因，可一次性获得人IgG。但是其小鼠的B细胞信号传递存在缺陷导致表达抗体的浆细胞数量少[8]。

2.2 TCTM Mouse小鼠平台

TCTMMouse小鼠平台是由日本麒麟公司石田功团队培育获得。第一代TCTMMouse创新性地利用人的人工染色体技术(HAC，human artificial chromosome)，将完整的人抗体重链和λ轻链(lambda light chain)免疫球蛋白基因导入胚胎干细胞中，获得了该小鼠。由于该小鼠携带了一条额外的染色体，导致TCTMMouse的转基因传代不稳定[9]。为了解决第一代TCTMMouse染色体不稳定的问题，第二代TC-mAbTMMouse改用鼠的人工染色体(MAC, mouse artificial chromosome)，将含有人抗体基因的MAC载体导入含有39条染色体的小鼠胚胎干细胞，从而获得正常的胚胎干细胞，保证了染色体遗传性状，经多次传代无染色体丢失。第二代TC-mAbTMMouse携带了完整的人重链、κ和λ轻链免疫球蛋白基因，同时敲除了小鼠自身的重链和κ轻链免疫球蛋白基因，最大限度保证了抗体多样性。目前利用该平台已成功开发了1个上市抗体药物(表2),但是，该小鼠存在和XenoMouse©类似的问题，B细胞信号传递存在缺陷和表达抗体的浆细胞数量少[13]。

2.3 TCTM Cattle牛平台

TCTMCattle牛平台是由日本麒麟公司石田功团队和美国原Hematech公司的Robl团队合作培育获得，现由美国SAB Biotherapeutics公司拥有并用于研发治疗性单克隆抗体和多克隆抗体[14]。其技术路线是采用HAC技术将人的重链和轻链(称：isKcHACΔ)转入牛的成纤维细胞，再通过体细胞克隆技术获得转基因牛，同时敲除了牛自身的重链、κ和λ轻链免疫球蛋白基因。但是HAC在基因组中游离存在，相当于基因组中多一条微小染色体，在繁殖和体细胞中不稳定，特别是在B细胞分裂和增殖过程中容易丢失，影响了BCR的信号传递和B细胞发育，其外周血淋巴细胞(PMBC)的人IgK+和牛IgM+的双阳性B细胞只有0.9%(正常牛的IgM+阳性细胞大约是20%)[15]。

2.4 HuMab© Mouse小鼠平台

HuMab©Mouse小鼠平台最初由GenPharm公司的Lonberg博士领衔培育获得，Medarex公司于1997年收购GenPharm公司并获得了该小鼠平台。2000年，Medarex公司与日本麒麟公司建立合作，通过杂交将HuMAb©Mouse小鼠与TCTMMouse小鼠组合，命名为KMTM小鼠(K代表麒麟，M代表Medarex)，整合了TCTMMouse小鼠人重链抗体基因的多样性与HuMAb©Mouse小鼠κ轻链抗体基因的稳定性，优化了HuMab©Mouse平台。2009年BMS公司以24亿美元的价格收购了Medarex公司。HuMab©Mouse小鼠经过优化，已携带全部人重链和κ轻链免疫球蛋白基因，同时敲除了小鼠自身的重链和κ轻链免疫球蛋白基因，可一次性获得人IgG[7]。目前利用该平台已成功开发了9个上市抗体药物(表2)。但是，该小鼠也同样存在B细胞信号传递有缺陷，表达抗体的浆细胞数量少。

2.5 OmniRat©大鼠平台

OmniRat©大鼠平台由英国科学家Bruggeman博士等牵头培育获得，2015年被Ligand公司收购并获得该平台的使用权。该大鼠携带有人/大鼠免疫球蛋白重链基因，包含24个人免疫球蛋白重链VH、大鼠的C区和人免疫球蛋白轻链[20个VK、15个VL(variable lambda region)以及KC(kappa constant region)和LC(lambda constant region)等]，同时敲除了大鼠自身的重链、κ和λ轻链免疫球蛋白基因。由于重链C区是大鼠来源，保证了B细胞受体的信号传递和抗体表达的浆细胞的数量，但需要对C区进行Fc置换才能获得全人抗体[16]。

2.6 Harbour H2L2 TM小鼠平台

Harbour H2L2TM小鼠平台由荷兰培育获得，2016年被和铂医药收购。该小鼠携带18个人免疫球蛋白重链VH和11个人免疫球蛋白轻链VK，同时敲除了小鼠自身的重链和κ轻链免疫球蛋白基因。Harbour H2L2TM小鼠选择了部分人利用率较高的人重链VH，但由于免疫球蛋白重链转基因的C区来源于大鼠，同样需要对C区进行Fc置换才能获得全人抗体[17]。

2.7 VelocImmune© Mouse小鼠平台

VelocImmune©Mouse小鼠平台为美国Regeneron公司培育获得。目前该平台已成功开发了5个上市抗体药物(表2)。该小鼠包含47个人免疫球蛋白重链VH和23个人免疫球蛋白轻链VK，保留了小鼠自身所有的C区及其它基因表达调控元件。VelocImmune©Mouse小鼠是通过同源重组和原位替换技术将小鼠免疫球蛋白C区前端的V(D)J基因精确替换为人免疫球蛋白基因，使该小鼠能够表达人抗体的V(D)J基因，由于保留了小鼠自身的C区，保证了B细胞信号传递和抗体表达的浆细胞的数量，但需要对C区进行Fc置换才能获得全人抗体[10]。

2.8 KyMouseTM小鼠平台

KyMouseTM小鼠平台由英国Kymab公司培育获得。该小鼠同样是将小鼠重链、κ和λ轻链免疫球蛋白的V(D)J基因通过同源插入，内源倒置(Cre-LoxP技术)，精确地将人的重链和轻链免疫球蛋白的V(D)J基因插入到小鼠的C区前端。它携带43个人免疫球蛋白重链VH、37个人免疫球蛋白轻链VK和34个人免疫球蛋白轻链VL；它拥有正常的B细胞受体结构，保证了BCR信号传递和抗体表达的浆细胞的数量，但相应的也需要对C区进行Fc置换才能获得全人抗体[11]。

2.9 MeMo© Mouse小鼠平台

MeMo©Mouse小鼠平台由荷兰的Merus公司培育获得。该小鼠包含人免疫球蛋白重链VH，以及重组后的人κ轻链基因(common light chain)，同时敲除了小鼠自身的免疫球蛋白重链基因。MeMo©Mouse小鼠产生抗体特点是所有抗体均拥有相同的轻链，容易构建双特异性抗体。但由于保留了小鼠自身的C区，因此也需要对C区进行Fc置换才能获得全人抗体[18]。

2.10 AlivaMab Mouse小鼠平台

AlivaMab Mouse小鼠平台由美国的Ablexis公司培育获得。该小鼠是将人免疫球蛋白重链、 κ轻链和λ轻链基因同源插入小鼠C区的前端，并将小鼠重链C区的CH1和铰链区序列由人的CH1和铰链区序列进行置换。因此，该小鼠的B细胞信号传递和浆细胞的数量正常，但同样需要对C区进行Fc置换才能获得全人抗体[19]。

2.11 TRIANNI Mouse©小鼠平台

TRIANNI Mouse©小鼠平台由美国TRIANNI公司培育获得。该小鼠携带有全部人免疫球蛋白重链VH、轻链VK和VL，且人免疫球蛋白基因的V(D)J序列是同源插入到鼠源免疫球蛋白基因的C区前端，小鼠免疫球蛋白λ轻链的J区序列由人的J区序列同源置换。由于该小鼠平台保留了小鼠自身C区序列，B细胞信号传递和浆细胞的数量正常，但相应也需要对C区进行Fc置换才能获得全人抗体[20]。

2.12 CAMouse©小鼠平台

CAMouse©(China Antibody Mouse)小鼠平台由中国的金迈博公司培育获得，采取的策略是基因打靶和随机插入的转基因技术。该小鼠携带32个人抗体重链VH，22个人抗体轻链VK和16个人抗体轻链VL，同时敲除了鼠源免疫球蛋白重链和κ轻链。CAMouse©小鼠平台的特点是在重链转基因载体中，包含了结构和序列完整的小鼠IgH 5′-端增强子，小鼠Sμ和IgM序列以及所有的内含子和调控序列等。因此，在淋巴细胞发育中，保证了B细胞信号传递，B细胞正常发育，能在小鼠体内正常完成IgM到IgG的转换，同时小鼠的浆细胞数量正常，可在体内一次性获得全人抗体[12]。

2.13 RenMabTM平台

RenMabTM平台由百奥赛图公司培育获得， RenMabTM小鼠是将小鼠重链和κ轻链的V(D)J基因原位置换为人抗体基因，置换大小分别为1.0 Mb和1.6 Mb。由于该小鼠保留了自身的内源C区序列，B细胞信号传递和浆细胞的数量正常，但是需要对C区进行Fc置换才能获得全人抗体[24]。

3 人源抗体转基因动物平台相关的专利

3.1 小鼠免疫球蛋白基因敲除技术专利

早期的人源抗体转基因小鼠采用随机插入人的免疫球蛋白基因，同时敲除小鼠自身的免疫球蛋白基因技术方案，这种技术方案主要涉及小鼠免疫球蛋白基因敲除专利，且大部分已过期，仍在有效期内和重要用途的是2008年Bruggemann博士和邹贤刚博士申请的小鼠λ轻链免疫球蛋白基因敲除专利，该专利核心是对小鼠内源性λ轻链的J2-C2和J4-C4区分别插入一个筛选基因和LoxP序列，然后通过Cre-LoxP技术将J2到C3之间的所有功能性J区和C区敲除，从而使小鼠的λ轻链失活，该专利对小鼠的λ轻链失活的相关权利进行了全面保护[22]。目前该专利已转移给Cresendo Biologics公司[23]。

3.2 牛的免疫球蛋白重链敲除和转基因改造技术和专利

2012—2013年，Sanford应用生物科学公司(SAB Biotherapeutics公司的前身)申请了题目为《用于在转基因动物中生产人类抗体的复杂的染色体工程》的中国(CN104755493A)和其他国家的专利[24]；阐明了牛IgH重链与其他哺乳动物的不同点，牛IgH重链具有两个独立的IgM表达和调控原件。该专利保护了牛IgM的基因打靶技术和人免疫球蛋白质基因的HAC重链载体的修饰技术。另外，该公司也用同样的MAC(isKcHACΔ)技术制备了人源抗体转基因山羊平台。

3.3 人免疫球蛋白V(D)J基因原位替换小鼠的免疫球蛋白V(D)J基因的技术专利

为保障人源抗体转基因小鼠BCR结构和信号的正常，保障B细胞正常发育，通常采用在小鼠免疫球蛋白的C区前原位插入人免疫球蛋白V(D)J基因，目前相关专利主要由Regeneron公司和kymab公司所拥有。Regeneron公司专利(US8502018，EP1360287，CN105861548A)的主要技术点是在小鼠免疫球蛋白C区前用人免疫球蛋白V(D)J基因原位替换小鼠的免疫球蛋白V(D)J基因[25-27]；而kymab公司专利(EP2604110，CN102638971B)的主要技术点是在小鼠免疫球蛋白C区原位插入人免疫球蛋白V(D)J基因，同时让小鼠的免疫球蛋白V(D)J区进行翻转，让其无法进行V-D-J-C区基因重排形成小鼠的抗体[28-29]。二者相同之处是在小鼠免疫球蛋白C区原位插入人免疫球蛋白V(D)J基因，区别在于KyMouseTM小鼠保留了自身的V(D)J基因，由于V(D)J区基因内尚有很多未知的基因和功能，因此保留小鼠的V(D)J区基因，可能具有更好的效果。

3.4 人源抗体转基因小鼠繁殖相关的ADAM6专利

小鼠ADAM6基因位于免疫球蛋白重链基因的VH和DH之间，由两个亚基组成(ADMM6 α和ADAM6 β)；它的主要功能之一与小鼠精子的游动能力有关。虽然在人的免疫球蛋白基因中有相似ADAM6基因的存在，但它不编码功能性蛋白质。因此在采用原位替换小鼠V(D)J基因的同时(图2)，会将小鼠的ADAM6基因连同V(D)J基因一起删除，造成该品系小鼠的繁殖障碍。需要补充ADAM6基因才能恢复繁殖力，而补充ADAM6的专利为Regeneron公司拥有(US8697940B2、EP2738258B1、CN105861548A)[27,30-31]。

图2 免疫球蛋白基因原位替换和ADAM6位置示意图Figure 2 IgH heavy chain homologous replacement strategy andthe location of ADAM6 gene

3.5 人源抗体转基因小鼠B细胞正常发育且一次性产生人IgG的专利

人免疫球蛋白V(D)J基因原位替换小鼠的免疫球蛋白V(D)J基因的技术虽然能保障B细胞正常发育，但其产生的抗体V区为人，C区是鼠的嵌合抗体，需要进行C区置换才能获得全人抗体。重庆金迈博公司的专利技术(CN105441455A)可使人源抗体转基因小鼠在BCR阶段使用小鼠免疫球蛋白C区基因，形成正常的BCR信号，保障B细胞正常发育，而在浆细胞阶段，通过类型转换形成全人IgG，是目前国际上唯一一个既能保障B细胞正常发育，又可一次性获得全人抗体的人源抗体转基因小鼠[12]。

4 结语

人源抗体转基因动物平台尽管在抗体开发中得到了广泛的应用，但由于技术的复杂性，以及专利保护的原因，目前只有少数单位掌握这一核心工具动物，且利用这一平台保持其抗体开发的优势地位。

人免疫球蛋白基因的序列都在MB以上，结构非常复杂，且至今还有部分序列，特别是在V-、D-和J-基因选择、重组和突变等方面的功能都不清楚。有的平台选择将修饰后的V-基因片段(人工V基因)连接在一起，这将影响V(D)J的利用率和突变等。最理想的人源抗体转基因动物平台是将转入人重链和两个轻链V(D)J的基因组序列(authentic genomic DNA)，完全利用动物体内B细胞发育和抗体发生机制，获得治疗性抗体。由于许多制药公司没有自己的抗体发现平台，需要利用其他(包括CRO)公司的人源抗体转基因动物平台获得治疗性抗体的源头序列，因此他们也需要从技术和专利的角度详细分析选择合适的人源抗体转基因动物平台，一方面提高获得候选抗体的概率，同时也要避免后续的知识产权纠纷。

2020年初以来，多家抗体制药公司主要致力于研发新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的治疗性中和抗体。Regeneron和铂医药等公司利用人源抗体转基因动物平台研发新型冠状病毒肺炎的治疗性抗体，其他公司如Pfizer和君实生物等利用感染病人的淋巴细胞分离中和性抗体。其中Regeneron公司的两个组合抗体最先获得FDA的紧急使用授权[32]。人源抗体转基因动物平台的优点是可以重复加强免疫，快速获得针对病毒产生的亲和力高和多样性丰富的中和性抗体。但已有的人源抗体转基因动物平台以小动物为主，而在突发性生物安全事件发生时，需要快速大量产生特异性多克隆抗体进行应急防控，因此培育人源抗体转基因大动物，并建立一定规模的群体，将是未来突发性生物安全事件防控的重要发展方向。