非洲猪瘟病毒及其疫苗研究进展

黄 霞， 康喜龙， 孟 闯， 顾 丹， 焦新安， 潘志明

(1.扬州大学 江苏省人兽共患病学重点实验室，扬州 225009；2. 扬州大学 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州 225009；3. 扬州大学 农业农村部农产品质量安全生物性危害因子(动物源)控制重点实验室，扬州 225009；4. 扬州大学 农业与农产品安全国际合作联合实验室，扬州 225009)

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的猪高致死性出血性疾病。高毒力株引起超急性和急性疾病，使猪群在感染后短时间内死亡率达100%。非洲猪瘟自1921年在肯尼亚被首次报道后，主要在撒哈拉以南的非洲国家呈地方流行。1957年ASF首次在欧洲葡萄牙出现，该疫情被扑灭后，又于1960年重现，后蔓延至撒丁岛、加勒比等地区。到20世纪90年代，除撒丁岛外，这些国家的疫情都被根除[1]。2007年，可能因东非受感染猪肉引入，ASF进入格鲁吉亚；然后，迅速蔓延到俄罗斯和东欧一些国家。2018年8月，ASF在我国沈阳首次被发现[2]。至2019年底，全国共报告发生162起ASF疫情，扑杀生猪近120万头。由于尚无针对ASF的有效疫苗，目前只能采取扑杀的方式控制疫情，给养猪业带来巨大损失。因此，迫切需要研发安全有效的疫苗应对当前的疫情。

1 非洲猪瘟病毒

1.1 结构与理化特性

ASFV是目前已知的唯一由虫媒传播的双链DNA大型囊膜病毒。ASFV病毒体是大约200 nm的二十面体，结构对称，由5个同心层形成，从内到外依次为内核、内核心壳、内膜、衣壳和囊膜。内核由基因组、核蛋白，以及类核形成。内核心壳是主要由多聚蛋白pp62和pp220组成的宽蛋白层。内膜紧挨核壳，电子显微镜下为单一的脂膜，含有p54、p17和p12蛋白。衣壳主要为p72蛋白。囊膜则是在病毒出芽过程中从细胞质膜获得[3]。ASFV基因组的长度为170～194 kb，有150～167 个开放阅读框(open reading frame, ORF)，可编码150多种蛋白质，其中包括结构蛋白和免疫调节蛋白。ASFV编码的多基因家族(multigene families, MGFs)占基因组的17%～25%，这直接决定了不同毒株基因组之间长度的变化[4]。

1.2 传播途径

ASFV可感染家猪和野猪，包括非洲的疣猪和丛林猪以及欧亚大陆的野猪。软蜱作为天然的病毒储存宿主，可通过叮咬传播病毒。被感染猪的组织或体液、未煮熟的猪副产品、受污染的材料和受感染的软蜱是该病传播的主要途径。而此次我国ASF的暴发，主要是由于感染猪及其副产品的大范围运输导致的传播[5]。

1.3 致病性

根据ASFV毒力的不同，ASF的临床症状可表现为长期持续感染和高度急性疾病。高毒力株感染后，可引起超急性和急性疾病，伴有高热、嗜睡、出血性病变等症状。血小板及淋巴细胞减少是其主要特征[6]。由中等毒力株引起的亚急性疾病，死亡率30%～70%。低毒力株一般导致低病死率和无血管病变的慢性疾病，可能会出现消瘦、关节肿胀和皮肤溃疡[7]。野猪和疣猪一般呈轻度或持续感染。长期持续感染的猪只可至少排毒70 d[8]，这是病毒持续存在的原因之一。

1.4 感染与免疫机制

ASFV进入细胞是一个依赖温度、能量、胆固醇和低pH值的过程，主要感染单核巨噬细胞。网格蛋白介导的内吞与肌动蛋白驱动的巨胞饮是ASFV侵入巨噬细胞的主要方式[3]。巨噬细胞作为免疫系统的多功能细胞，对感知和杀灭病原体以及随后激发先天性和适应性免疫反应都必不可少。然而，ASFV具有独特的免疫逃逸机制可抵抗巨噬细胞杀伤，ASFV对单核吞噬细胞的细胞嗜性以及其在体内复制和调节巨噬细胞功能的能力是其致病的关键因素[9]。

ASFV可通过调节细胞因子和促炎因子的表达来实现免疫逃逸。I型干扰素(interferon I, IFN-I)是先天免疫系统的重要组成部分，可抑制病毒在细胞内的复制、成熟和细胞间传播。有研究表明使用IFN-α预处理猪巨噬细胞可显著抑制ASFV复制[10]。ASFV还可编码多种免疫调节蛋白，这些蛋白会干扰并下调宿主多种免疫调节蛋白质的表达。ASFV感染期间，白介素-1(interleukin 1, IL-1)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNFα)等150多种细胞因子失调。ASFV编码的A238L就是一种多功能免疫调节蛋白，可通过抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的活化来调节促炎因子和细胞因子的分泌。宿主对抗ASFV入侵的另一种主要防御策略是通过凋亡清除受感染的细胞。然而ASFV可通过表达能够竞争和隔离促凋亡蛋白的蛋白质(如A179L、A224L和DP71L)逃逸早期凋亡[11]。

2 非洲猪瘟疫苗研究进展

20世纪50年代第一次报道了从ASFV感染中恢复的猪能够免受病毒的再次攻击[12]。ASFV感染后，存活的猪只可以产生强烈的保护性免疫应答，这表明研制有效的非洲猪瘟疫苗是可能的。虽然在过去几十年中，已开展了对ASF灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等多项研究，但到目前为止仍未获得一种安全、有效的ASF疫苗。2020年3月，中国农科院哈尔滨兽医研究所创制的ASFV疫苗已通过农业农村部评审，获准在黑龙江、新疆和河南三地开展临床试验[13]。

2.1 灭活疫苗

作为控制传染性疾病的重要措施之一，灭活疫苗通常被优先选择研究。虽然灭活疫苗具有抗原性，但由于物理或化学灭活手段而丧失了感染能力，无法产生持久的免疫应答是这类疫苗的主要缺点之一。

Forman等用戊二醛与洗涤剂分别处理ASFV感染后的猪肺泡巨噬细胞，并将其免疫猪。结果发现攻毒后戊二醛处理组可更快速地产生血清学反应，病毒血症水平轻微降低；而洗涤剂处理组未观察到明显血清学反应，对同源攻击不具有免疫保护作用[14]。除此之外，也有研究通过其他方式灭活病毒，如灭活感染细胞的提取物、纯化灭活的病毒粒子等，均不能产生有效的免疫保护[15]。而Blome等[16]的研究表明加有佐剂PolygenTM与Emulsigen®-D的灭活ASFV制剂可在猪中诱导产生针对ASFV p73和p30的特异性抗体，但仍未观察到有效的免疫保护作用。截至投稿时，未有传统ASF灭活疫苗研发成功的报道。

2.2 减毒活疫苗

2.2.1 传统减毒活疫苗

通过病毒在体外或非宿主动物中连续传代致弱病毒的减毒活疫苗已成功控制多种病毒性疾病。同样，在ASF减毒疫苗的研制中，已进行了多种天然或体外减毒的ASFV免疫的实验。有研究显示天然减毒的OURT88/3和NH/P68 ASFV毒株可诱导产生良好的免疫保护，抵抗强毒株的攻击[17]。虽然使用传统方法减毒的ASFV毒株免疫猪会产生针对同源病毒的长期抵抗力，但其很少能抵抗异源病毒的攻击。此外，传统减毒活疫苗通常会产生副作用，如瘀斑、坏死灶等，这限制了其在生产中的进一步应用。传统减毒活疫苗还可能导致慢性或持续性感染，并有恢复毒力的风险。

2.2.2 基因工程减毒活疫苗

目前，通过比较基因组和功能基因组学研究已经确定了与病毒毒力和宿主应答相关的ASFV基因。TK、UK、9GL是已知与ASFV毒力相关的基因，而MGF360和505/530基因可抑制宿主产生I型IFN。这些基因的缺失可导致病毒毒力的下降，同时能够诱导针对同源病毒的保护性免疫应答。Monteagudo等[18]将CD2v/EP402R缺失的Ba71 ASFV毒株(基因I型)免疫猪后，其能够诱导产生保护性免疫应答，抵抗同源Ba71或异源E75(基因I型)和Georgia07(基因II型)ASFV强毒株的攻击。这种交叉保护反应在众多基因缺失候选疫苗中比较少见，表明基于CD2v的减毒活疫苗具有较大的开发前景。2019年，军事医学科学院军事兽医研究所扈荣良教授团队[19]以我国流行ASF毒株SY18为亲本构建了MGF和CD2v双基因缺失株，对猪安全且接种猪能100%抵抗亲本毒株的攻击。此外,近期中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员团队[20]以我国ASFV HLJ/18株为骨架，构建了不同基因缺失的重组病毒。通过在猪体内的多项试验，遴选出一株7基因缺失病毒(HLJ/18-7GD)可在猪体内完全减毒，不能转化为强毒株，对猪的致死性ASFV攻击有完全的保护作用。

多基因缺失株尽管在安全水平上有所提高，但与单基因缺失株相比，丧失了原有的保护作用。Abrams等[21]同时缺失了天然减毒株OURT88/3中的UK和NL毒力基因后，免疫保护效力由100%降至66%。这可能是由于多种基因缺失使得病毒复制受到了极大的影响，而免疫保护的实现需要一定程度的病毒复制水平。

此外，研究表明不同毒株缺失相同基因后的免疫保护效果也不一定相同。例如，Sanford等[23]通过缺失Malawi毒株中的TK基因使之减毒，并成功诱导产生了对同源病毒攻击的保护[22]。但同样缺失Georgia07强毒株中的TK基因则丧失了免疫保护效力。

2.3 亚单位疫苗、核酸疫苗及病毒载体疫苗

与减毒活疫苗相比，基于抗原和单个或小部分基因的疫苗具有更高的安全性。一些与ASFV病毒附着和内化相关的蛋白，如p54、p30、p72和CD2v等，已用于亚单位疫苗、核酸疫苗及病毒载体疫苗的研制(表1)。研究表明这些疫苗可以诱导机体产生特异性的抗体反应，但大部分只能提供部分的免疫保护。以下对研究较多的p54、p30、p72和CD2v蛋白的特性及相关疫苗进展进行概述。

2.3.1 p30与p54

p30由ASFV的ORFCP204L基因编码，蛋白大小约为23.6 ku。 p30在ASFV感染早期表达，通常于感染后2～4 h产生，12 h后合成减少，在整个感染期间均能检测到，与病毒入侵细胞密切相关[24]。作为ASFV重要的结构蛋白，p30也是最具抗原性的蛋白之一，可诱导感染动物产生中和抗体。目前，p30被广泛应用于ASFV的血清学检测。

p54由E183L基因编码，是ASFV表达的早期膜蛋白，大小为19.9 ku。p54位于病毒颗粒的内囊膜，在病毒的吸附和入侵中发挥重要作用。研究表明p54可直接与动力蛋白C-末端的轻链8(LC8)结合，形成病毒跨膜结构域，实现病毒在胞质内的转运。ASFV感染后，p54-LC8复合物利用一个含13个氨基酸残基的序列，与抗凋亡蛋白Bcl-2结合，消除其对细胞凋亡的抑制作用，同时caspase 3和caspase 9被激活，进而诱导细胞凋亡[25]。

p30和p54在病毒感染过程中具有相似作用，常联合用于亚单位疫苗的研制。 Gómez-puertas等[26]单独用p30或p54蛋白免疫猪后，可以诱导产生中和抗体，但免疫的猪不能抵抗强毒株的攻击。然而，采取同时免疫p54和p30的策略，攻毒后，猪临床症状有所延缓，病毒血症也得到缓减，50%的猪可免受E75毒株的攻击。

同样，p54和p30也是DNA疫苗的靶标抗原。Argilaguet等[27]使用编码p54和p30融合蛋白的重组质粒免疫仔猪，并不能产生中和抗体和T细胞应答。然而将p54和p30与ASFV血凝素蛋白的胞外可溶性结构域(sHA)融合，构建重组质粒免疫猪后可诱导特异性的体液和细胞免疫应答，但未发挥免疫保护作用[28]。最近，Lacasta等[29]的研究使用编码泛素蛋白的基因序列与上述构建的p54/p30/sHA质粒融合表达时，不仅可诱导体液与细胞免疫应答，也可抵御少量病毒的攻击。

2.3.2 p72

p72产生于病毒感染晚期，是ASFV主要的衣壳蛋白，由B646L基因编码。p72序列高度保守，且具有高度抗原性和免疫原性，常用于病毒检测和疫苗的研制。使用基于杆状病毒表达的ASFV蛋白p30、p54、p72和p22免疫猪，虽然在感染动物体内检测到了高滴度的中和抗体，但不能提供免疫保护[30]。陈新新等[31]利用反向遗传技术构建表达p72 的重组新城疫病毒免疫BALB/c小鼠后，可产生较高滴度的p72特异性抗体，还可引发T细胞增殖和IFN-γ、IL-4等细胞因子的分泌。尽管p72已与多种蛋白联合制作疫苗，但都缺乏相关的动物实验来验证其保护效力。

2.3.3 CD2v

CD2v由ORFEP402R基因编码，是ASFV唯一的糖蛋白，与T淋巴细胞表面黏附受体CD2类似。研究表明CD2v协助红细胞结合到感染细胞和胞外病毒粒子以促进病毒扩散。由于猪红细胞表面具有CD2受体，因此ASFV病毒极易吸附到红细胞上[25]。此外，缺失了CD2v的Ba71减毒株可产生针对同源病毒和异源病毒的交叉免疫保护，且能产生特异性 CD8+T 淋巴细胞应答，证实了CD2v还可抑制淋巴细胞增殖[15]，这使得CD2v成为亚单位疫苗研发的主要抗原蛋白之一。使用重组CD2v蛋白免疫猪只，然后利用强毒E75株进行攻毒，猪只可产生CD2v特异性IgG抗体，尽管有两只动物检测到携带病毒，但免疫保护效率高达100%[32]。最近，Sunwoo等[33]使用组合的ASFV质粒DNA(CD2v、p72、p32和p17)和重组蛋白(p15、p35、p54和p17)联合免疫猪，进行免疫效果评价。结果显示接种疫苗后只检测到少量的抗原特异性T细胞，未检测到中和抗体，同时不能提供免疫保护。由于CD2v相关亚单位、核酸等疫苗的研究相对较少且缺少对强毒攻击的免疫保护评价，所以后续需要进一步对其研究。

除上述4种热点蛋白外，pp62、A151R、K205R及B602L等也都可作为靶抗原，用于疫苗研制的研究，但较少的细胞免疫保护以及保护效率方面数据的缺乏不足以支撑疫苗的研发。因此，为了进一步建立ASF亚单位疫苗研发平台，需要更深入地探究相关的ASFV保护性抗原与现有病毒株多样性之间的关系。

表1 ASFV亚单位疫苗、核酸疫苗及病毒载体疫苗

3 我国非洲猪瘟疫苗研发的挑战

尽管目前针对ASF灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等进行了多方面尝试研究，但结果并不尽如人意，所以ASF疫苗的研发还面临许多挑战。其一，研究所得疫苗大多只能提供同源保护，只有极少数能提供小部分的异源保护。而ASF具有24种基因型，这使得对疫苗的交叉保护能力的要求有进一步提高。其二，由于ASFV的生物安全等级较高，需要在生物安全三级及以上实验室才可开展病毒分离鉴定、活病毒培养、动物接种(感染)等实验活动，目前我国批准开展ASFV相关实验的实验室有中国动物卫生与流行病学中心、国家外来动物疫病诊断中心等8家单位，这在一定程度上限制了ASF疫苗多样发展。其三，在研发过程中，实验动物的使用也存在一定问题。小鼠模型常用于疫苗研制的前期工作，以证明疫苗的安全性和免疫原性，但这些结果很难复制到猪上。如p54/p30核酸疫苗在小鼠模型中具有较强免疫原性，但免疫猪后并不能产生免疫原性，表明了使用猪模型评估ASF疫苗显得尤为重要。

4 总结与展望

ASF在许多国家和地区呈现地方性或流行性能通过各种传播途径扩散到无ASF的国家，这对全球养猪业构成了巨大威胁。目前ASF控制策略在很大程度上依赖于严格的生物安全措施和扑杀，但这些措施所起的作用是有限的，所以急需安全有效的疫苗来控制疾病，并从野猪和家猪中根除病毒。目前，尽管已经尝试了不同类型的疫苗，但是尚无市售的ASF有效疫苗。灭活疫苗不能提供保护，亚单位疫苗也通常是部分保护，而减毒活疫苗已显示可以提供同源保护，是目前最有望投入生产的，但仍存在安全性问题。然而由于ASFV结构复杂，我们对其免疫机理和免疫逃逸机制认识的缺乏严重阻碍了疫苗的研发进展。因此，需要继续努力揭示ASFV致病与免疫机理以及与宿主细胞相互作用的机制，为疫苗的研发带来新的认识和途径。