邻近标记技术在神经生物学中的应用与展望

范玲玲， 沈国民

(1.河南科技大学 基础医学院，洛阳 471000；2.河南省血栓与止血国际联合实验室，洛阳 471000)

2012年，美国科学家Alice Ting实验室开发了一种称为“邻近标记”(proximity labeling，PL)的实验方法，旨在研究在空间上相互分开的蛋白质分子如何组装成为功能完整的大分子复合物[1]。这种方法就是在活细胞中将目标蛋白和酶融合表达，酶催化小分子(通常是生物素)去共价标记目标蛋白邻旁的蛋白质[2-3]，这些蛋白经细胞裂解被分离出来，通过质谱分析进行鉴定[图1(a)]。PL已被应用于探索新的细胞器成分[4-5]，并用于识别具有很高空间特异性的蛋白-蛋白相互作用伴侣[6-7]。研究表明，PL是一种具有纳米级空间分辨率的分析分子相互作用和定位模式的方法[8]。

1 PL的原理及其应用

依据融合的酶不同，目前PL可分为两类：基于过氧化物酶的PL和基于生物素连接酶的PL。基于过氧化物酶的PL是在细胞或组织中融合表达工程化的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase，APEX)[1，9]或辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，用生物素-苯酚(biotin-phenol，BP)[3]或其变体[10-11]预处理细胞或组织，过氧化物酶将BP氧化成苯氧自由基，苯氧自由基与邻旁的蛋白质电子密度较高的侧链发生反应[图1(b)]，从而将生物素与邻近蛋白共价连接。使用与固相载体相连的链霉亲和素磁珠捕获生物素标记的蛋白质，并进行质谱鉴定。Lam 等[9]通过A134P 的定向突变对APEX进行改进得到APEX2，APEX2 技术在催化效率和活性方面较 APEX 均有提升。因为过氧化物酶反应的快速动力学，所以这种方法可以用来研究动态蛋白质相互作用网络。最近就有多项研究利用APEX融合G蛋白偶联受体来探究配体刺激后不同时间点的蛋白相互作用组[12-13]。因为HRP/APEX在细胞固定后仍具有活性，可以氧化二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)而被 OsO4着色，所以HRP/APEX也可用于电子显微镜(EM)下固定细胞的造影剂，极大地推动了DAB 染色标记方法在电镜成像中的应用，也使得研究人员在进行蛋白质组学研究之前，可以先检测过氧化物酶融合蛋白，以获得其准确的亚细胞定位[1]。

(a)工程化的酶(绿色)与目标蛋白或在感兴趣的亚细胞区域融合表达，将生物素(红色)共价标记在邻旁内源性蛋白(灰色)上(细胞裂解后，生物素化蛋白被链霉亲和素磁珠富集，酶切成肽，然后进行质谱分析)；(b)对基于过氧化物酶APEX的PL，APEX将BP氧化为苯氧基，苯氧基继而共价标记邻近内源性蛋白的富含电子侧链的氨基酸残基，如酪氨酸；(c)基于BioID的PL，外源性生物素与内源性ATP配合使用，BioID将生物素转化为活性的生物素化AMP从酶的活性位点释放出来，与邻近蛋白上的赖氨酸残基发生反应使其被标记。

BioID是大肠杆菌生物素连接酶(BirA)的R118G突变体，用于融合生物素连接酶的PL。BirA以生物素和ATP作为底物来产生活性生物素-5′-AMP(bioAMP)中间体，然后将其转移到细菌羧化酶蛋白的赖氨酸残基上[图1 (c)]。与基于过氧化物酶的PL相比，BioID的一个主要限制是：由于其反应动力学较慢，需要18～24 h的反应时间才能完成标记，从而妨碍了BioID用于动态过程的研究。此外，BioID体积较大(35 ku，而APEX为28 ku)，可能会比APEX获得更多的错误靶标，增加假阳性率。近年来，一个小版本(27 ku)的BioID——BioID2已经问世[14]。与BioID相比，BioID2具有许多优点：提高了靶向融合蛋白的选择性，减少了生物素的需要量，提高了邻近蛋白的标记效率。最近，又改造出两个更新版本的生物素连接酶：TurboID和miniTurbo，可以更高效地完成标记[15]。随着PL技术发展，新的连接酶不断出现。Ramanathan等[16]在研究 RNA 与蛋白互作时，从枯草芽孢杆菌中设计出一种衍生的新型BirA类似物BASU(BirA*, 来自Bacillussubtilis)，其动力学比BioID快3个数量级，且显示出较高的信噪比。

结合文献报道以及本人在临近标记技术实际应用中得到的经验，总结如下。(1)融合表达BioID或APEX存在目的蛋白定位不正确的情况，造成假阳性结果，因此，需要设计合理的阳性或阴性对照，以剔除与目的蛋白空间距离上邻近但非相互作用的蛋白。(2)APEX催化反应依赖于血红素，所以在血红素缺乏的环境中需补充血红素来辅助APEX发挥其催化功能。(3)邻近标记反应中，如果蛋白质缺少暴露在表面的可以被生物素标记的氨基酸，或者某些蛋白被包裹在大的分子复合体中，会导致邻近标记实验失败，间接产生假阴性结果。(4)如果目的蛋白定位信息不明确，直接使用邻近标记方法，尤其是基于APEX 的技术是有风险的。随着今后对现有邻近标记技术局限性不断改进和发展，该技术的应用前景将更加巨大。

2 PL在神经生物学中的应用

长期以来，尽管大家一直对如何确定神经元之间调节信息传递的分子成分很感兴趣，但由于神经组织在空间和时间维度上的复杂性和异质性，对许多突触亚区的分子成分进行生化纯化一直是一个棘手的问题。近年来的研究表明，PL技术在阐明突触间隙以及抑制性突触后致密区(inhibitory postsynaptic density，iPSD)的分子组成方面具有重要应用价值。

Loh等[10]在离体培养的神经元中使用基于HRP的PL鉴定了兴奋性和抑制性突触间隙的蛋白质组(这是生化纯化几乎不可能完成的)，结果分别发现199 种和42种相关的蛋白质，并确定其中糖基磷脂酰肌醇锚蛋白Mdga2作为一个潜在的特异性因子影响抑制性突触的突触前神经递质Neuroligin-2募集。另一研究用同样方法在培养的皮质神经元中，鉴定出新的兴奋性突触间隙候选蛋白，筛选并成功验证受体酪氨酸蛋白磷酸酶ζ[17]。这些研究说明过氧化物酶介导的PL在鉴定突触间隙蛋白组学方面的强大适用性，有助于阐明在正常和疾病状态下突触异质性的变化。

采用类似的方法，Chung等[7]利用APEX标记技术获得了离体培养神经元的α-突触核蛋白相互作用组。α-突触核蛋白是神经元富含的蛋白质，参与突触囊泡的形成和转运，但它在神经元中的异常聚集是引起某些神经疾病如阿尔茨海默症、帕金森病的关键因子[18-19]。通过APEX标记方法鉴定到与α-突触核蛋白相关的225个蛋白，其中不仅包括内吞及囊泡转运相关蛋白，也包括很多mRNA结合蛋白以及蛋白合成的相关蛋白，在全细胞水平上系统揭示了α-突触核蛋白在神经细胞中的异常聚集可能是由多种因素造成的[7]。

在活体动物的脑组织中，iPSD是目前唯一通过PL技术研究的亚细胞结构[20]，因为标记探针的递送和标记步骤与体外培养的细胞大不相同。BioID在活体小鼠大脑中的应用是PL在神经生物学领域研究中的一个里程碑，为了在体内表达BioID融合蛋白，研究人员将编码生物素连接酶融合蛋白的腺病毒注射到新生小鼠的大脑皮层和海马中，为了达到最大数量的突触标记，尽可能优化精确的病毒注射时间、生物素剂量和标记时间。生物素进入小鼠大脑比进入离体培养的细胞更具挑战性，他们选择腹腔注射生物素，因为生物素可以穿透各类组织，包括血脑屏障。该研究鉴定并验证了iPSD的许多以前未知的成分，包括抑制性突触后蛋白(inhibitory synaptic proteins，InSyn)1和InSyn2，敲除InSyn1导致突触后抑制性位点减少，抑制性微电流频率降低，增加了海马的兴奋性，这一研究凸显了PL在新兴神经生物学研究中的巨大潜力。

此外，为了捕获神经组织中细胞类型特异性的细胞表面蛋白质组，Li等[21]改良了Loh等离体培养神经元的PL过程，利用HRP介导的PL对果蝇脑细胞表面蛋白质组进行分析，优化标记物递送方式、原位生物素反应和组织样品处理，发现了20 个调节神经环路形成的细胞表面分子，其中，许多以前认为与神经发育无关的进化保守蛋白家族。由于酶的快速动力学，这种基于HRP的PL反应只需几分钟就能完成，提供了具有高时间分辨率的细胞表面相关蛋白质组，并最大限度地减低了H2O2的潜在毒性。这些发现说明PL技术的高时间分辨率在发现脑环路背后的分子机制方面有明显优势。Menon等[22]采用BioID识别发育中的皮质神经元的E3泛素连接酶TRIM9和TRIM67蛋白-蛋白邻近网络，确定神经元TRIM相互作用伙伴。验证了一系列候选蛋白，包括细胞骨架调节蛋白、胞浆蛋白转运蛋白、胞外和胞内调节蛋白，以及突触调控蛋白。以此为基础，未来可能会发现TRIM9和TRIM67调控神经元形态和功能的新蛋白和机制。为了鉴定人类原钙黏蛋白19(protocadherin 19，PCDH19)功能的蛋白复合物，研究者构建了Pcdh19-BioID融合蛋白，利用PL技术鉴定其邻近蛋白。结果表明，PCDH19相互作用组富含调控Rho家族GTPases的蛋白、微管结合蛋白和调控细胞分裂的蛋白[23]，为未来研究PCDH19这种对神经系统正常发育至关重要的蛋白的细胞和分子生物学提供了重要基础。

3 PL应用所面临的挑战

3.1 PL在体应用需要将探针送入组织

由于PL技术需要同时向细胞递送两种物质：编码酶的DNA和小分子底物，因此在体内进行PL时，一个需要考虑的因素是如何将底物分子递送到目标器官或组织。在上述的iPSD研究中是通过腹腔注射生物素进入大脑[20]。哺乳动物自身不合成生物素，但生物素是脂肪酸生物合成所必需的维生素。低浓度(< 5 μmol/L)生物素进入细胞主要是通过Na+依赖的多种维生素转运体1(Na+- dependent multivitamin transporter，SMVT1)介导的，SMVT1在肠、肝、脑、心、肺、肾等组织中广泛表达，当生物素浓度超过25 μmol/L时，就会发生被动扩散[24]。利用这些途径，BioID标记所需的生物素原则上可以通过食物供应。然而，不同动物的摄食行为有所不同，这种递送方式可能会导致动物个体之间标记的显著差异。iPSD的研究采用每日腹腔注射外源性生物素，为控制生物素用量提供了一种简便有效的方法。此外，另一个体内BioID标记的实验中，研究人员把表达BioID的肿瘤细胞注射到小鼠体内，再通过腹腔注射提供外源生物素，在肿瘤异种移植模型中研究c-MYC相互作用的分子伴侣[25]。

有研究人员选择基于过氧化物酶的在体PL，以便更好地控制标记时间。基于APEX的PL体内底物递送比BioID难度更大，但最近已经有成功的例子[26-28]。在昆虫和蠕虫体表有一层紧密的疏水角质层起着保护层的作用，对环境中的小分子高度不渗透，最近两项将APEX蛋白质组学应用于活体秀丽线虫(C.elegans)肠道的研究，使用RNAi敲除一种糖基转移酶基因bus-8，以破坏表皮完整性，并使BP和H2O2能够递送到蠕虫体内[26-27]。另一种方法是将目标组织从完整的动物体内分离出来，如用APEX研究果蝇(Drosophila)肌肉细胞线粒体基质的蛋白质组[28]，就是在适当的组织培养基中分离目标组织并进行邻近标记，使组织在H2O2作用的短时间内维持在生理环境中，为活体组织实施高时间分辨率的邻近标记提供了一种可推广的策略。

虽然H2O2在APEX的 PL反应中浓度较低(1 mmol/L)，且作用的时间很短(<1 min)，但H2O2有可能导致氧化应激从而引起细胞毒性[29]。因此，将H2O2标记限制在低浓度和短时间窗内对最小化副作用至关重要。对体积极小的组织，H2O2可以像在离体培养的细胞中一样，在整个样品中迅速渗透和反应[26-28]。目前的脑片电生理学研究，在人工脑脊液中急性制备脑片的方法，可以考虑用于脊椎动物脑组织PL样品，可有效缩短脑组织在H2O2中的孵育时间，从而减轻其毒性作用。

3.2 在体实验需要克服高背景

在体应用PL的另一个挑战是组织比离体培养的细胞含有更多的背景物质。背景可能有两个来源：一是组织中某些成分与链霉亲和素的非特异性结合，二是内源性生物素化蛋白。如果只是转染生物体或某个组织中的一小部分细胞，或者当目标蛋白质组非常小且分布比较局限时，就会出现前一个问题，这样，生物素化(期望的)蛋白质与非生物素化(不期望的)蛋白质的比例很小，要想纯化生物素化蛋白很难。为了解决这个问题，在亲和纯化之前对样品进行粗分馏可能有助于提高生物素化蛋白与背景的比例。

在处理少量细胞或某个局部蛋白质组时，另一个背景来源——内源性生物素化蛋白也是必须关注的问题。例如，在果蝇的大脑中，内源性生物素化蛋白非常丰富，尤其是在胶质细胞中，这些内源性生物素化的蛋白量可能大大超过了BioID或APEX生物素化蛋白的量，并竞争性地与链霉亲和素磁珠结合。在这些研究中，分馏或分离可能有助于去除不相关的背景。所以，未来开发非生物素标记的富集蛋白质组的研究方法将有很大意义。以Rhee等[3]为例，他们已经证明APEX可以用烷基苯酚而不是生物素苯酚来标记蛋白质，烷基可以与各种叠氮化物试剂结合，富集蛋白就可以不再使用链霉亲和素磁珠。

另外，组织中还有一些其他背景来源，对基于过氧化物酶的PL，内源性过氧化物酶的活性也可以产生背景，例如，在秀丽线虫的肠道中，发现内源性过氧化物酶活性高于正常培养细胞[27]。因此，设计标记或未转染对照组对减少来自非特异性结合物、内源性生物素化蛋白和内源性过氧化物酶活性的干扰尤其重要。减少组织中背景的另一个策略是增加目的信号，比如，可以延长反应时间来标记更多物质。基于过氧化物酶的PL，有时信号低是因为过氧化氢酶高表达，过氧化氢酶可以抑制H2O2，或者因为过氧化物酶辅因子血红素过低，可以通过添加血红素来改善。

4 邻近标记在神经生物学中的应用前景

4.1 特定时空条件下相互作用蛋白质组鉴定

在过去几年里，蛋白质组学结合生物化学方法(如分馏法、免疫沉淀法和化学交联法)已经在鉴定许多神经结构如突触末梢、突触小泡、PSD和活性区的分子组成方面发挥重要作用。先进的成像方法，如阵列断层扫描，也为神经生物学家提供了大脑分子结构的高分辨率地图，然而，阵列断层扫描一次只能扫描20个靶点，而且可用的抗体也很有限，同时基于生化纯化的蛋白质组学假阳性率高，细胞内污染物如线粒体和核蛋白，大概占突触小体鉴定成分的20%～40%[30]。而PL这种高分辨率的鉴定时空特异性相互作用蛋白的方法极大地弥补了现有技术的不足。

4.2 亚细胞结构蛋白质组鉴定

除了已经利用PL蛋白组学鉴定的亚细胞结构分子组成外，神经元还具有许多功能专一的亚细胞结构，例如：发出轴突的轴丘[31]，以及在某些细胞类型中执行独特功能的高度特异性的结构。电生理及结构研究表明，作为哺乳动物听觉的主要机械传感器——毛细胞的纤毛尖端具有独特的机械电转换机制，目前其分子特性未知[33]，所以基于PL的蛋白质组学分析为系统地鉴定这些功能特殊区域的蛋白质分子组成提供了前所未有的机会。越来越多的证据表明，神经胶质细胞不仅是支持细胞，还广泛参与调节神经系统的发育和功能[34]。神经胶质细胞与神经元连接处的蛋白质组学图谱将帮助进一步了解神经胶质细胞与神经元相互作用的分子基础。另外，神经胶质细胞的致病机理涉及许多神经系统疾病，如阿尔茨海默病等[35]。在正常和病理条件下，不同类型胶质细胞中不同区域(如内涵体、溶酶体、线粒体、细胞表面)的基于PL的蛋白质组学研究，可以为深入了解胶质细胞在这些疾病中的作用提供有效手段。

探究高度复杂的动态相互作用的蛋白质组将为进一步了解神经生物学中的关键分子提供途径。虽然已经通过基因分析鉴定出大量对神经发育和信号转导至关重要的分子[36]，但大多数仍然是“孤儿”基因，我们对其相互作用的分子伴侣和功能都知之甚少。将基于PL的蛋白质组学进行这些分子的研究，可以捕获稳定的或瞬时的分子伴侣，并获得一个全面的分子相互作用网络。正如GPCR通路所展示的那样[12-13]，高时间分辨率的过氧化物酶PL能够鉴定在不同条件下的动态相互作用蛋白质组，这些蛋白质分子中有许多与人类疾病有关[37]，系统地分析病理条件下的分子伴侣不仅有助于阐明病理机制，还有可能发现新的疾病相关基因。

鉴于BASU在检测活细胞中的 RNA-蛋白质相互作用比其他PL方法更有优势[38]，BASU已成为研究 RNA-蛋白互作的有力补充[39]，在神经生物学领域，也将为深入解析 RNA 的重要生物学功能提供强有力的手段。