安徽齐云山石斛傅里叶红外光谱分析

田胜尼， 李亚楠， 胡艺璇， 李 纯

(安徽农业大学 生命科学学院，合肥 230036)

石斛(Dendrobiumnobile)是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生常绿草本植物[1]。它是我国传统滋补中药，药用部分是新鲜或干燥的茎，生物活性成分主要为多糖、石斛碱和酚类物质等，具有益胃生津、降血糖及增强免疫力等功效[2-8]。我国石斛品类繁多、分布范围广，但不同产地、不同品种的石斛价格和药用价值差异较大[9-11]。目前石斛销售市场品种混杂，以假乱真的现象时有发生，严重影响了石斛产业健康发展[12]。而傅里叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)是一种对物质内部分子结构定性或定量的技术，已被广泛运用在中草药、食品等诸多研究领域，广泛用于中药材真伪优劣鉴别、中药活性成分定量分析，包括石斛的鉴定分析[13-18]。邓月娥等[19]对不同产地金钗石斛的红外光谱分析发现，产自云南和浙江的金钗石斛(D.nobile)存在差异；沈宗根等[20]对3种石斛属植物与细叶石仙桃(Pholidotacantonensis)的红外光谱分析比较得出铜皮石斛(D.moniliforme)可作为铁皮石斛(D.officinale)的药用替代品，而细叶石仙桃不能作为替代品，大大缓解了铁皮石斛稀缺的压力。刘文杰等[21]采用傅里叶红外光谱法测定了4个不同产地的环草石斛光谱图，通过比较谱峰强度的差异，可对其进行鉴别。此外，在中药临床应用中，同一种药材的不同部位的功效存在一定的差异，需要利用科学的方法对其进行区分，以确保入药合理。李建蕊等[22]用红外光谱法对三七的主根、剪口、筋条、绒根等不同部位的光谱特征进行研究，找出各部位化学成分之间的差异及相关性。傅里叶变换红外光谱中每个分子都有自己的光谱特征，对波段位置、宽度和强度的分析提供了有关细胞组成和生理状态的信息[23]。随着科学技术的发展，光谱测定技术将会更好地与计算机、化学计量学等学科结合，在中药领域应用等发挥重要作用。

在安徽省黄山市休宁县齐云山野外科考发现，其山上有自然定居的石斛(D.nobile)。该石斛经组培快繁，现可大面积栽培。有关来自齐云山石斛化学成分与市场上广泛栽培的六安和温州铁皮石斛之间是否存在差异，目前尚未见有研究。本文以六安、温州两地产的铁皮石斛为对照，利用傅里叶红外光谱技术研究齐云山石斛根、茎、叶的红外光谱特征，分析探讨同一产地石斛不同器官及不同产地石斛相同器官之间所含化学成分种类差异，为齐云山地区野生石斛资源的保护、人工种植与栽培及可持续利用等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用的材料为齐云山石斛(D.nobile)、六安铁皮石斛(D.officinale)和温州铁皮石斛(D.officinale)。齐云山石斛是指原产自安徽省黄山市休宁县齐云山野生的石斛。齐云山石斛材料采自黄山市皖乡农业科技有限公司齐云山石斛种植基地。该公司将休宁县齐云山石壁野生的石斛采集进行快繁栽培所得。六安铁皮石斛和温州铁皮石斛指安徽省六安市和浙江省温州市两产地的铁皮石斛。

1.2 方法

1.2.1 药材粉末的制备

采集新鲜样品，洗净、烘干后并分离出根、茎、叶，分别剪成小段，置于60 ℃干燥箱内烘至恒重，用中药粉碎机粉碎。过200目筛得到样品粉末后分装于不同的试管中并标记。齐云山石斛的根、茎、叶分别标记为a、b、c；六安铁皮石斛的根、茎、叶分别标记为d、e、f；温州铁皮石斛的根、茎、叶分别标记为g、h、i。

1.2.2 红外光谱的预处理

首先将溴化钾粉末置于玛瑙研钵中充分研磨并压片，作为空白对照。然后取不同产地石斛的不同器官粉末样品与溴化钾粉末以2∶100的比例放入玛瑙研钵中搅磨均匀，并压片。最后将所有压片置于傅里叶红外光谱仪上扫描，进行压片测试，光谱扫描范围400～4 000 cm-1，仪器分辨率4 cm-1，扫描次数16次，得到红外光谱图。

1.3 数据处理

采用Origin 8.0软件，对所得的数据进行处理，绘制红外光谱图进行分析。

2 结果与分析

2.1 齐云山石斛根、茎、叶的红外光谱图比较

石斛的药用部位主要是茎，但是由于市场石斛资源稀缺，有学者提出将石斛整株作为药用的观点，以减缓市场供不应求的压力[6,24]。图1为齐云山石斛根、茎、叶3个部位的红外光谱图。

a：齐云山石斛根；b：齐云山石斛茎；c：齐云山石斛叶。图1 齐云山石斛根、茎、叶的红外光谱图Figure 1 Infrared spectra of roots, stems and leaves ofDendrobium nobile from Qiyun Mountain

从图1可以看出，齐云山石斛根、茎、叶的红外光谱图均出现多个吸收峰，整体上基本相似。根、茎、叶3个营养器官主要吸收峰分别为3 424、2 921、1 629和1 079 cm-1；3 416、2 920、1 735、1 630和1 028 cm-1；3 426、2 920、2 853和1 736 cm-1等。通过各器官红外光谱图分析，其主要特征如下所述。

多糖物质的振动带为1 200～700 cm-1、指纹振动区为950～600 cm-1。在1 200～900 cm-1光谱范围内，齐云山石斛的根、茎出现阶梯连续递增的峰：其中根的红外光谱图中出现2个峰，只有1个强峰；茎的红外光谱图由3个小型吸收峰组成，最强峰与附近的峰形成强双峰，左侧有1个肩峰；叶的红外光谱图中也出现了3个峰，但不呈连续递增趋势，而是最强峰与附近的峰形成强双峰。在950～600 cm-1光谱范围内，齐云山石斛根、茎、叶3个部位器官均有属于C-O-C和CH2振动的吸收峰出现。1 150 cm-1附近的吸收峰归属为纤维素葡萄糖物质的C-O振动[24]；830 cm-1附近的多个特征峰均为弱吸收峰，归属为C-O-C不对称面外伸缩振动和CH2非平面摇摆振动的特征峰[25]；760 cm-1附近的吸收峰主要为糖环骨架伸缩振动的指纹峰。

羰基、酰胺和芳环的振动带范围为1 750～1 400 cm-1。1 750～1 700 cm-1是羰基振动频区；1 655～1 590 cm-1是N-H弯曲振动频区；1 420～1 400 cm-1是酰胺I带振动频区；1 730 cm-1附近的吸收峰主要为酯羰基振动；1 510 cm-1附近的吸收峰主要为芳环吸收峰。在3 050～2 850 cm-1和1 465～1 340 cm-1光谱范围内，齐云山石斛根、茎、叶3个器官均出现吸收峰，说明其均含有烷烃基，又因在1 735 cm-1附近的吸收峰属于酯羰基振动吸收，所以三者都含有烷烃醛。在1 655～1 590 cm-1频区内，齐云山石斛的根、茎、叶均出现吸收峰，但在1 510 cm-1附近，只有其根、叶出现吸收峰，其中根的吸收峰不明显、叶的吸收峰较为明显，而茎没有出现吸收峰，有肩峰，说明齐云山石斛的根和叶中含有芳香类物质，茎中没有。在1 420～1 400 cm-1频区内，出现的吸收峰为酰胺I带振动吸收；但1 540 cm-1附近没有吸收峰，因此齐云山石斛根、茎、叶中的酰胺大部分为叔酰胺[26]。蛋白质、酯类和多糖类的混合振动带范围为1 500～1 200 cm-1。1 500～1 350 cm-1是C-H弯曲振动频区；1 465～1 340 cm-1是烷烃的特征峰。1 420 cm-1、1 350 cm-1附近的吸收峰分别为CH2剪切振动、CH3对称式剪切振动。1 320 cm-1附近的吸收峰为O-H面内弯曲振动，是紫丁香基的特征峰；1 240 cm-1附近吸收峰为木质素中的苯羟基C-O伸缩振动。3个器官在1 320 cm-1、1 250 cm-1和1 150 cm-1附近均出现了吸收峰，说明齐云山石斛的根、茎、叶中均含有紫丁香基、木质素和纤维素。

光谱特征表明：齐云山石斛根、茎、叶3个器官在4 000～900 cm-1频区内红外光谱大体相似，三者所含的化学成分中均有酯类、黄酮类、叔酰胺、蛋白质、木质素以及包含纤维素在内的多糖类物质等。在900～500 cm-1指纹区内，茎、叶的红外光谱相似度较高，根的红外光谱与二者区别较大，说明齐云山石斛茎、叶中所含的化学组成成分的含量相似度较根高，因此，齐云山石斛的叶可作为其茎的替代品入药。同时，比较三者成分含量的异同，红外光谱技术可以快速鉴定石斛茎的真伪，防止市场出现以根、叶混淆茎的情况。

2.2 安徽齐云山石斛与六安铁皮石斛、温州铁皮石斛的红外光谱图的差异分析

2.2.1 根的红外光谱图比较分析

图2表明，齐云山石斛、六安铁皮石斛和温州铁皮石斛根的红外光谱在4 000～1 500 cm-1光谱范围内相似度较高，但在1 500～500 cm-1光谱范围内相差较大。1 150 cm-1附近的吸收峰归属为纤维素葡萄糖单元的振动；1 150～950 cm-1频区内的吸收峰归属为C-O伸缩振动[27-28]。

a：齐云山石斛的根；d：六安铁皮石斛的根；g：温州铁皮石斛的根。图2 齐云山石斛、六安铁皮石斛、温州铁皮石斛的根的红外光谱图Figure 2 Infrared spectra of roots of Dendrobium nobile from QiyunMountain, Dendrobium officinale from Lu’an and Wenzhou

在3 420 cm-1附近，3个产地石斛根的红外图谱均出现了属于酚类分子羟基伸缩振动的吸收峰，强度较大且峰形较宽，但六安铁皮石斛根的吸收峰没有另外两者宽。在3 050～2 850 cm-1频区内，三者均出现了属于CH2不对称伸缩振动的吸收峰(2 920 cm-1附近均有1个吸收峰)；并且在1 465～1 340 cm-1频区内，也出现了属于C-H弯曲振动的吸收峰，说明三者都含有烷烃官能团；又根据1 735 cm-1附近出现的酯羰基振动吸收峰，表明3个产地石斛的根均含有烷烃醛。在1 655～1 400 cm-1频区内，出现的多个吸收峰为酰胺I带振动吸收峰，但由于1 540 cm-1附近没有吸收峰存在，结果表明酰胺大多为叔酰胺。在1 500～1 200 cm-1频区内出现4个吸收峰，前两者是C-H弯曲振动吸收峰，后两者分别是紫丁香基的特征峰、木质素中苯羟基C-O伸缩振动吸收峰；并根据1 510 cm-1附近的吸收峰，可知三者均含有芳香类物质(六安铁皮石斛根的吸收峰最明显，齐云山石斛根的吸收峰不明显)[29-30]。在1 300～500 cm-1频区内，三者红外光谱区别显著，其中六安铁皮石斛与温州铁皮石斛根的红外光谱图相似度相对较高。

光谱特征表明，齐云山石斛、六安铁皮石斛和温州铁皮石斛根的红外光谱在官能团区大体相同，均含有酯类、蛋白质、黄酮类、叔酰胺、木质素以及包含纤维素在内的多糖类物质等，但各化学成分的含量不完全相同。而在指纹区差别较大，齐云山石斛根的吸收峰更明显，六安铁皮石斛与温州铁皮石斛根的红外光谱区别较小，两者相似度最高。所以3个产地石斛根所含化学成分相似，但仍有些内含物质组成成分存在差异。

2.2.2 茎的红外光谱图比较分析

图3为3处不同产地石斛茎的红外光谱图。从图3可以看出，3个产地石斛茎的红外光谱在3 420 cm-1处均有一个较宽的O-H伸缩振动吸收峰，强度较大，但宽度不同，六安铁皮石斛茎的吸收峰较另外两者宽。在3 050～ 2 850 cm-1频区内，三者均有吸收峰，且在2 920 cm-1附近均有1个吸收峰。

b：齐云山石斛的茎；e：六安铁皮石斛的茎；h：温州铁皮石斛的茎。图3 齐云山石斛、六安铁皮石斛和温州铁皮石斛的茎的红外光谱图Figure 3 Infrared spectra of stems of Dendrobium nobile from QiyunMountain, Dendrobium officinale fromLu’an and Wenzhou

在1 465～1 340 cm-1频区内，出现了C-H弯曲振动吸收峰，说明含有烷烃官能团；又因在1 735 cm-1附近有酯羰基振动吸收峰，因此3个产地石斛茎中均含有烷烃醛。1 655～1 400 cm-1频区内为酰胺I带振动吸收峰，且1540 cm-1附近没有吸收峰存在，表明酰胺大多为叔酰胺。1 510 cm-1附近，仅温州铁皮石斛的茎出现吸收峰，说明只有温州铁皮石斛茎中含有芳香类物质。在1 500～1 200 cm-1频区内出现的4个吸收峰，归属为C-H弯曲振动、紫丁香基振动以及木质素中苯羟基中C-O伸缩振动。在1 200～900 cm-1频区内，3个产地石斛茎的红外图谱左侧均有1个肩峰，其中六安铁皮石斛、温州铁皮石斛茎的红外光谱出现了3个吸收峰，其中2个形成强双峰；且温州铁皮石斛茎的红外光谱呈阶梯连续递增；而齐云山石斛茎的红外光谱出现了2个吸收峰。在1 300～500 cm-1频区内，齐云山石斛茎的红外光谱与六安铁皮石斛茎、温州铁皮石斛茎的红外光谱有明显区别。

光谱特征表明：齐云山石斛、六安铁皮石斛和温州铁皮石斛茎的红外光谱在官能团区大体相同，均含有酯类、蛋白质、黄酮类、叔酰胺、木质素以及包含纤维素在内的多糖类物质等，但各成分的含量高低存在差异。在指纹区三者具有明显区别，温州铁皮石斛茎的吸收峰较齐云山石斛、六安铁皮石斛茎的吸收峰多，说明其成分更复杂，如温州铁皮石斛的茎中含有芳香类物质，其他2个产地石斛的茎中不含有芳香类物质。

2.2.3 叶的红外光谱图比较分析

3处不同产地石斛叶的红外光谱如图4所示。从图4可以看出，三者在3 420 cm-1附近均有1个峰强较强且吸收峰较宽的峰，归属为O-H伸缩振动，但三者吸收峰的宽度不同，六安铁皮石斛叶的吸收峰较另外两者宽。在3 050～2 850 cm-1频区内，三者有吸收峰，且在2 920 cm-1附近均有1个吸收峰；1 465～1 340 cm-1频区内，出现了属于C-H弯曲振动的吸收峰，说明三者含有烷烃官能团。在1 740 cm-1附近有属于酯羰基振动的吸收峰，表明三者叶中均含有烷烃醛。

c：齐云山石斛的叶；f：六安铁皮石斛的叶；i：温州铁皮石斛的叶。图4 齐云山石斛、六安铁皮石斛和温州铁皮石斛的叶的红外光谱图Figure 4 Infrared spectra of leaves of Dendrobium nobile from Qiyun Mountain, Dendrobium officinale from Lu’an and Wenzhou

在1 655～1 400 cm-1频区内，出现了多个归属为酰胺I带振动的吸收峰，但在1 540 cm-1附近没有吸收峰，表明三者含有的酰胺大多为叔酰胺。在1 510 cm-1附近，仅齐云山石斛叶具有吸收峰，而温州铁皮石斛和六安铁皮石斛的叶没有吸收峰，只有肩峰，说明齐云山石斛的叶中含有芳香类物质，其他2个产地石斛的叶不含有。在1 500～1 200 cm-1频区内，三者红外光谱区别较大。齐云山石斛叶有4个吸收峰，六安铁皮石斛叶和温州铁皮石斛叶只有3个吸收峰，但吸收峰的类型相同，归属为C-H弯曲振动、紫丁香基振动以及木质素中苯羟基中C-O伸缩振动。在1 200～900 cm-1频区内，3个产地石斛叶的红外光谱差异明显，齐云山石斛叶有3个吸收峰，最强峰位于中间，与右侧峰形成强双峰；六安铁皮石斛叶有4个吸收峰，最强吸收峰为第3个吸收峰；温州铁皮石斛叶有3个吸收峰，最强峰位于中间，其右侧有一处肩峰。1 150 cm-1附近，三者均出现归属为纤维素葡萄糖单元振动的吸收峰；1 150～950 cm-1频区内的吸收峰归属为C-O伸缩振动；在900～500 cm-1频区，三者红外光谱也存在差异。

光谱特征表明，齐云山石斛、六安铁皮石斛、温州铁皮石斛的叶红外光谱在官能团区大体相同，均含有酯类、蛋白质、黄酮类、叔酰胺、木质素以及包含纤维素在内的多糖类物质等，但其物质的含量不完全相同。指纹区内3个产地石斛叶的红外光谱图区别较大，说明3个产地的石斛叶在组成物质方面不尽相同，其中齐云山石斛叶中含有芳香类物质，而六安铁皮石斛和温州铁皮石斛的叶不含有芳香类物质。

3 结论

利用傅里叶红外光谱法对齐云山石斛、六安铁皮石斛和温州铁皮石斛根、茎、叶的红外图谱进行分析。结果表明，齐云山石斛的不同器官根、茎、叶的红外光谱在官能团区极为相似。3个器官所含的主要化学成分比较相近，为酯类、蛋白质、黄酮类、叔酰胺、木质素以及包含纤维素在内的多糖类物质等，但各物质含量存在一定差异。此外，齐云山石斛根和叶中均含有芳香类物质，而茎中没有。齐云山石斛叶与茎的红外光谱相似度较高，其叶可成为茎的药用替代品。从3个不同产地、不同品种的根、茎、叶的红外光谱实验发现：3个产地石斛具有明显的红外“指纹”特征吸收峰。3个产地石斛所含的化学成分基本相同，主要为酯类、蛋白质、黄酮类、叔酰胺、木质素以及包含纤维素在内的多糖类物质等，但齐云山石斛茎和温州铁皮石斛叶中不含芳香类物质，六安铁皮石斛茎、叶中均不含芳香类物质。因此，通过傅里叶红外光谱法可有效鉴定石斛不同种质资源间的化学成分差异。

致谢：本文得到美国南达科他州立大学自然资源管理系徐岚教授的指导和帮助。