显微化学去龋技术临床及生物学研究

张富华 管理霞 余晓沁

中图分类号:R781.1 文献标志码：A doi:10.3969/j.issn.1001-3733.2021.06.021

临床上治疗龋病常规使用高速涡轮机和慢速手机的机械方法完全去除患牙的龋坏组织，然后进行牙齿修复；该方法虽然快速简便易行，但是治疗过程中患者会产生酸痛敏感症状，而且在处理深部病变时，这种技术会增加患牙牙髓暴露的风险。为减少创伤和提高治疗过程中的舒适程度，学者们提出了微创牙科治疗(minmum-intervention dentistry)[1]的理念。在龋病治疗领域中,微创治疗要求以最小的牙体创伤去净龋损组织,最大程度地减少患者痛苦,降低牙髓暴露发展成牙髓炎的风险。

化学去龋方法是首先用能溶解龋损组织的化学药物软化龋损牙体组织,然后再以手用器械将坏死组织完全清理干净[2]。目前,常用的化学去龋系统为 Carisolv系统 , 又称伢典，由Carisolv凝胶和 Carisolv手用工具组成。化学去龋基于微创治疗的理念,已经证明可以去除污染较严重的龋坏牙本质，同时保留脱矿的受影响的牙本质[3]。如果结合使用手术显微镜,用来增强术区的光照与放大,从而保证龋洞预备及充填的质量。本研究拟通过比较显微化学去腐技术和传统涡轮机技术去龋过程中患者对疼痛的反应和1年后患牙的预后来评价去龋技术的临床应用情况；同时通过生物学技术比较不同去龋技术去龋效果的差异。

1 材料与方法

1.1 材料和器械

Carisolv Ⅲ凝胶、特制手工工具(MediTeam Dental AB 公司，瑞典)；盖髓材料iRoot BP Plus(Innovative Bioceramix公司，加拿大)；充填材料用玻璃离子水门汀(松风公司，日本)；自酸蚀粘接剂、3M FiltekTMZ350XT通用型纳米树脂(3M公司，美国)；牙科手术显微镜(ZeissPico，德国)；橡皮障(康特公司，瑞士)。

1.2 实验分组的方法

选取2018 年01 月～2019 年08 月至合肥市口腔医院牙体牙髓二科就诊的患者60 名，60 例患牙，使用随机数表方法将患者随机分为实验组和对照组，每组30 名。2 组患者一般资料比较差异无显著性。该研究得到合肥市口腔医院伦理委员会批准(批号： Y20180107)，在患者知情并签署知情同意书的情况下进行。

纳入标准：(1)患者年龄在18 岁以上的男性或女性，总体健康状况良好；(2)在根尖片射线照片中，至少可以发现1个深度龋齿病变；X线片上显示龋损至牙本质深层；(3)无牙髓炎症状；(4)术前根尖片中根尖无透射性影像；(5)第一或者第二磨牙。

排除标准：(1) 不可逆性牙髓炎的临床症状或者牙髓炎疼痛病史；(2)瘘管或肿胀的存在；(3)外部或内部牙根吸收；(4)牙齿松动或者有叩诊疼痛；(5)孕妇。

操作前所有患牙均要拍摄根尖片，评估根尖周组织是否正常。使用温度测试和牙髓电测试的方法评估患牙牙髓状态。由两名高年资牙髓病专业医生共同评估，形成共识。

实验组：显微镜下伢典化学去龋技术手工去龋。患牙上橡皮障，暴露目标牙齿，调节显微镜，聚焦至龋坏处(2.5 倍)。使用高速裂钻打开去腐通路，去除无基釉至釉牙本质界后，将Carisolv透明凝胶状注入龋洞内，注满为止，静置30 s，Carisolv配套的特制手持器械在龋洞壁上轻轻摩擦，至凝胶浑浊，用灭菌水冲洗干净，重新注入清洁的凝胶，如此反复，至注入的凝胶不再浑浊，直至显微镜下观察均为健康牙体组织。

对照组：常规涡轮机技术机械去龋。在橡皮障下，高速球钻配合慢速球钻去除腐质，至肉眼下无明显龋坏组织，并用手持器械轻轻摩擦洞壁时感到洞壁坚硬，说明龋已去尽。

去腐标准:按照国际龋病共识协作组(international caries consensus collaboration，ICCC)推荐，对于本次研究对象的患牙去腐使用选择性去龋(selective removal)标准。 进行选择性去龋时，窝洞侧壁和髓壁去龋标准不同。为获得最佳的粘接封闭性，窝洞边缘应为健康的牙釉质，窝洞侧壁应为硬化牙本质，即与健康牙本质有类似的触感，用探针或手用挖匙划过牙本质表面时有刮擦音。为避免牙髓暴露，窝洞髓壁可保留软化牙本质。

实验组和对照组的患牙去龋后均使用iRoot BP Plus覆盖软化牙本质，然后玻璃离子垫底，纳米树脂分层充填。实验组及对照组临床操作均由同一名操作者完成，由配合护士记录临床观测指标。

1.3 临床观测指标

使用疼痛视觉模拟评分(visual analogue scale，VAS)方法[4]进行疼痛分级。使用0～10标度记录术中疼痛程度，患者根据主观感受评价疼痛：0为无痛，1～3为轻度疼痛，4～6为中度疼痛，7～10为重度疼痛。

12 个月后对每颗纳入研究的患牙进行评价其治疗的成功或者失败。患牙维持对温度和电测试的正常反应，没有自发性疼痛，没有叩诊压痛，没有窦道或肿胀，并且根尖片上不存在透视性影像则被评价为成功。反之，则评定为失败。

去龋前后牙体组织中变形链球菌活菌数量的变化。通过样本qPCR临界循环数(cycle threshold, Ct)数值表示活菌的浓度。

1.4 样本DNA提取与定量聚合酶链反应

实验组和对照组去龋完成前后，分别使用无菌挖勺收集患牙软化牙本质并称重。

按照李聪聪等[5]的方法制备PMA储备液并进行叠氮溴化丙锭(PMA)处理样本。将所有样本利用细菌基因组DNA快速提取试剂盒(ATP Genomic DNA Mini Kit®; ATP Biotech, Taipei,Taiwan)提取基因组DNA，作为荧光定量PCR的反应模板。操作按照生产厂家说明书进行。

采用Taqman®探针(赛默飞，美国)，qPCR 方法定量检测变形链球菌[6]。 每次定量PCR反应都设空白对照(以相同体积的双蒸水取代 DNA)，每次测定设 2 个平行样。

1.5 qPCR标准曲线的建立

将提取到的 DNA 标准品采用去离子水10 倍梯度稀释，进行PCR反应，以标准品浓度的对数值为横坐标，以 Ct数值为纵坐标建立qPCR的标准曲线(图1)。

图1 qPCR的标准曲线

通过标准曲线计算:(1)样本中目标细菌细胞总数：不加PMA使用qPCR获得；(2)样本中目标细菌生活细胞数：使用PMA-qPCR获得；(3)样本中目标细菌死亡细胞数：qPCR-(qPCR-PMA)。

1.6 统计学分析

根据卡方检验的结果比较2 组间患牙治疗的成功率；根据T检验结果分析两组病例术后VAS自评分值的差异；使用独立样本T检验来比较每组中不同去腐方法龋腐前后的生活细菌组织浓度的改变和组间生活细菌组织浓度的变化。

2 结 果

2.1 牙齿治疗成功率

1 年后随访,一共有7 颗牙齿失去随访(实验组3 颗；对照组4 颗)；对照组和实验组的成功率分别为71.4%(16 颗牙齿失败)和91.2%(5 颗牙齿失败)。差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 牙齿治疗成功率Tab 1 Success rate of caries treatment

2.2 患者VAS自评分值

T检验发现实验组的分值高于对照组(P=0.000)(表2)。

表2 患者VAS自评分值Tab 2 VAS scales of pain of the subjects

2.3 去龋前后变形链球菌活菌浓度的变化

实验组和对照组均发现挖掘后活菌浓度显著降低(P<0.01)(表3)。2 种去龋技术在降低深部龋损病灶中细菌活菌浓度方面差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

表3 去龋前后qPCR的Ct值Tab 3 Changes in CT value of qPCR after caries removal

3 讨 论

本实验比较了显微化学去龋(实验组)与常规涡轮机方法去龋(对照组)2 种去龋技术临床效果和预后。使用实验组方案处理的牙齿中预后比较好的原因可能与在去腐对牙髓造成的机械和热刺激的减少有关[7-8]。研究表明使用Carisolv凝胶在没有器械放大的情况下去除龋损组织，在1 年后使用CBCT时检查，只有65.4%的患牙被认为是健康的，这一研究结果与对照组研究结果相似(73.3%)，但低于使用手术显微镜+Carisolv凝胶去腐的实验组的成功率(91.2%)，提示术中使用手术显微镜，可以增强操作者的视野，则可能有助于避免术中不必要的组织损伤[9]。

在本研究中，与涡轮去腐技术相比，实验组患者术中感到疼痛明显较少。其他研究者也对Carisolv化学去龋法术中的患者的感受进行了研究，结果和本研究相似[1,10-11]。然而，Peric等[12]观察到在他们的研究中，有很大比例的受试者在使用Carisolv去腐时方法报告疼痛，这种结果的差异变化可能是由于疼痛的主观性质以及个体间疼痛阈值的变异性所致。机械涡轮去腐技术和化学去腐技术之间疼痛评分的差异可能因为后一种方法操作过程中没有涡轮手机的声音，减轻了患者的焦虑。同时化学凝胶本身可能具有隔热作用，并覆盖了牙本质小管，隔绝了操作过程中对牙髓的物理刺激。

虽然使用牙科钻头可以去除更多龋牙本质，从而去除更多细菌，然而Carisolv凝胶由于其自身具备的抗菌性和高pH值可降低细菌细胞活力(Azrak等，2004)[13]。本研究发现两种去龋方法都可以将龋损处生活细菌组织浓度降低，但是实验组的降低程度明显高于对照组。但本研究的结果与之前Lager等[14]的结果研究不太一致，他们发现这两种去龋技术在降低细菌组织浓度方面具有相同的效率; Ammari等[15]，研究结果的差异可能是因为之前的研究没有考虑研究细菌的细胞活力，单独使用定量PCR不能区分活细菌和死细菌，只能指示存在的细菌总量。判断感染性疾病病灶中是否存在生活致病菌对于疾病的精确地诊断和治疗有着更重要意义，因此本研究采用PMA结合定量PCR方法检测深龋病损处生活变形链球菌的数量的变化，以此来判断去龋技术的去腐效率可以更符合临床实际情况，而且病损处生物标志物方面的检测可能具有预测原位治疗结果的潜力。PMA是一种光敏DNA结合染料,可以选择性结合细胞死亡后“暴露”出的DNA，这样定量PCR时就只扩增未结合PMA的生活细胞DNA，不扩增已结合PMA的死亡细胞DNA[16-18]。

本研究发现应用Carisolv凝胶结合手术显微镜的微创化学去腐方案更能保持患牙牙髓根尖周的健康，而且可以减少术中的疼痛不适，并能明显降低龋损处活细菌浓度。