支气管肺泡灌洗液液基细胞学联合肿瘤标志物鉴别良恶性孤立性肺结节的价值*

李 斌，白东明，杨晓辉

（山东省德州市人民医院胸外科，德州 253000）

肺癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位[1-2]。大多数肺癌的前身为孤立性肺结节（solitary pulmonary nodules，SPN），SPN是一种类圆形的肺内病灶，边界清晰，直径一般小于3 cm，常呈现结节状良性或恶性病变[3-4]。有研究发现，超过50%的SPN会发生恶性病变[5]。因此，临床早期检测肺部结节，准确鉴别其组织学特征有重要意义。目前，鉴别SPN良恶性的方法主要有纤支镜刷检与活检、CT引导下经皮穿刺活检、胸腔镜取活检病理诊断等[6-8]，但这些方法检查费用昂贵，且为有创检查。支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）作为在支气管镜检查基础上形成的一种新的检查方法，因其可克服痰液中病理细胞少、留取不规范等缺点[9]，其诊断肺癌的价值逐渐被学者重视。基于BALF的液基细胞学检测（liquid based cytology test，LCT）改善了传统涂片的制作方法，提高了肺癌诊断的特异度与敏感度[10]。此外，有研究报道，肺癌患者BALF中的肿瘤标志物细胞角蛋白片段21-1（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）的含量高于肺炎患者，且3 者联合可有效诊断肺癌[11]。推测BALF LCT 联合CEA、CYFRA21-1 和NSE 检测可进一步提高鉴别良恶性SPN 的准确性。本研究采用电化学发光法检测BALF 中CEA、CYFRA21-1 和NSE 的含量，探讨BALF LCH 联合CEA、CYFRA21-1 和NSE 检测鉴别良恶性SPN的价值，以期为SPN的诊断提供新的指标。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2017 年5 月1 日至2020 年5 月1 日在山东省德州市人民医院胸外科收治的107例SPN患者为研究对象。病例纳入标准：（1）经组织学或细胞学证实为良性或恶性SPN；（2）年龄≥18岁；（3）SPN直径＜3 cm；（4）心肾功能正常。排除标准：（1）已行放化疗者；（2）穿刺后结节者；（3）磨玻璃密度结节者；（4）结节内伴有空洞形成者。根据SPN 是否为良恶性将患者分为良性SPN 组和恶性SPN组。本研究经本院医学伦理委员会审批通过，患者知情同意并签署知情同意书。

1.2 支气管肺泡灌洗液液基细胞学检查

采用中华医学会呼吸病学分会BALF细胞学检测技术规范[12]，胸部CT 辅助定位，局部麻醉经活检孔注入2%利多卡因1 mL，然后将纤维或电子支气管镜顶端楔入段支气管开口处，再从活检孔快速注入37 ℃的灭菌生理盐水，立即以8 kPa 负压吸引回收液体，每次注入50 mL，总量200 mL。将回收液筛网过滤后均分成2 份，装入硅塑瓶，行LCT 检查。在盛有BALF 的离心管中加入保存液、消化液，充分摇匀、震荡，静置15～30 min，梯度离心收集细胞后，用美国TriPath Imaging 公司生产的AutoCyte PREP 型液基细胞全自动制片机制片，制成直径为13 mm 的细胞薄片，苏木精—伊红（HE）染色，在无水酒精中脱水10 min，依次在二甲苯中透明1 min，树脂胶封固涂片后显微镜下阅片。液基标本采用2级分类诊断法，即将细胞检查结果分为阴性、阳性。所有涂片均由2 位病理学专家同时阅片镜检证实。

1.3 电化学发光法检测BALF 中CEA、CYFRA21-1 和NSE的含量

抽取适量的BALF，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，采用电化学发光法检查CEA、CYFRA21-1和NSE 的含量，其中检测仪器为德国西门子XP 全自动化学发光分析仪和深圳新产业MAGLUMI-4000全自动电化学发光分析仪。校准品、质控品以及试剂均为原装配套，检查步骤严格按照说明书进行。

1.4 统计学方法

采用R 3.5.1（https://www.r-project.org/）软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征曲线（ROC）评估BALF LCH、CEA、CYFRA21-1 和NSE 诊断SPN 的价值，计算ROC 曲线下面积（AUC）、准确性、敏感度、特异度，采用Clopper-Pearson法[13]计算对应值的95%CI，同时，基于logistic回归评估BALF LCH、联合CEA、CYFRA21-1 及NSE鉴别良恶性SPN 的价值，各指标AUC 的比较采用DeLong检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

2017 年5 月1 日至2020 年5 月1 日收集到115例SPN 患者，共107 例患者符合标准纳入最终分析。其中恶性SPN 患者63 例（58.9%），男36 例、女27 例，平均（56.9±5.6）岁；组织类型；鳞癌18 例，腺癌38 例，小细胞癌3例，大细胞癌2 例，其他类型肿瘤2 例；根据TNM 分期系统，Ⅰ期17 例，Ⅱ期32 例，Ⅲ期12 例，Ⅳ期2 例；平均结节大小（2.2±0.6）cm。在44例（41.1%）良性SPN患者中，男28 例、女16例，平均（55.3±7.9）岁；其中肺结核11 例，炎性假瘤9 例，肺炎9 例、结节病15 例；平均结节大小（2.1±0.7）cm。两组患者年龄、性别、结节大小等比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 BALF LCT 检查结果及CEA、CYFRA21-1 和NSE的含量

BALF LCT检查结果显示，在63例恶性SPN中BALF LCT 阳性检出35 例，在44 例良性SPN 中BALF LCT 阴性检出23 例，与金标准的一致率为54.2%。电化学发光法检测结果显示，恶性SPN 组CEA、CYFRA21-1 和NSE 的含量均高于良性SPN组，差异有统计学意义[CEA:(59.5±19.3) μg/Lvs(12.3±6.5) μg/L,t=1.735,P＜0.001；CYFRA21-1:(45.7±16.8) μg/Lvs(13.6±6.6) μg/L,t=3.637,P＜0.001；NSE:(55.3±22.0)μg/Lvs(20.1±10.3)μg/L,t=2.418,P＜0.001]，见图1。

图1 两组CEA、CYFRA21-1及NSE的含量比较

2.3 BALF LCT 联合CEA、CYFRA21-1 及NSE 对SPN的诊断效能

ROC 曲线结果显示，BALF LCT、CEA、CYFRA21-1 及NSE 诊断SPN 的AUC 为0.546(95%CI:0.464～0.628)、0.722(95%CI:0.650～0.795)、0.523(95%CI:0.439～0.608)、0.735(95%CI:0.666～0.805)，经多因素logistic回归分析获得联合预测因子，联合预测因子=0.964+0.965×BALF LCT+11.219×CEA-8.965×CYFRA21-1-1.235×NSE（其中BALF LCT阳性为1，阴性为0；CEA、CYFRA21-1 和NSE 表示对应的含量）。联合检测的最佳截断值为0.32，对应的AUC 为0.801(95%CI:0.718～0.847)，明显高于BALF LCT、CEA、CYFRA21-1 及NSE（均P＜0.001）单独诊断SPN 的AUC。其余诊断效能评价指标，见表1和图2。

表1 BALF LCT联合CEA、CYFRA21-1及NSE诊断SPN的效能

图2 BALF LCT、CEA、CYFRA21-1 及NSE 诊断SPN 的ROC曲线

3 讨论

目前，鉴别良恶性SPN的方法主要有纤支镜刷检与活检、CT引导下经皮穿刺活检、胸腔镜取活检病理诊断等，但均有一定的局限性。近年来研究发现BALF LCT 对胃癌的早期诊断有一定的价值。朱建勇等[14]研究发现，与传统的涂片方法相比，LCT诊断周围型胃癌的敏感度和特异度均较高，其原因可能与LCT 具有涂片背景清晰、厚薄均匀，细胞细微结构清楚；三维立体突出，可基本保持组织学结构，并可重复制片等优点有关。SPN为大多数肺癌的前身，因此鉴别SPN 的良恶性，可在一定程度上早期发现肺癌。为此，本研究探讨BALF LCT诊断SPN 的价值，结果发现在63 例恶性SPN 中BALF LCT 阳性检出35 例，在44 例良性SPN 中BALF LCT 阴性检出23 例，与金标准的一致率为54.2%，提示BALF 对良恶性SPN 的鉴别有一定的价值。但是ROC 曲线分析结果显示，其AUC 仅为0.546，表明LCT 虽然有诊断价值，但其诊断效能并不理想。

随着分子生物学的发展，大量有价值的肿瘤标志物不断被发现，如CEA、CYFRA21-1 和NSE 等，这3种肿瘤标志物亦可以通过BALF获得。CEA是一种相对分子量约为200 000的细胞膜表面的糖蛋白，亦是最为常见的肿瘤标志物，在肺癌及其他肿瘤中含量升高[15]。CYFRA21-1 是细胞角蛋白19 的一个可溶性片段，主要存在于肺肿瘤上皮的细胞质内，它能在激活的蛋白酶作用下降解，以溶解片段的形式释放入血，是非小细胞肺癌（NSCLC），尤其是鳞癌的重要标志物[16]。NSE是由两个γ亚单位组成的糖酵解酶，它存在于神经内分泌细胞和神经源性肿瘤中，小细胞肺癌（SCLC）是一种神经内分泌起源的肿瘤，故NSE 对SCLC 具有一定的诊断价值[17]。本研究检测CEA、CYFRA21-1 和NSE 在BALF 中的含量，结果发现恶性SPN 组CEA、CYFRA21-1和NSE的含量均高于良性SPN组，与上述结果基本一致。但是在诊断方面，CEA、CYFRA21-1 和NSE诊断SPN 的AUC分别为0.722（0.650～0.795）、0.523（0.439～0.608）、0.735（0.666～0.805），提示3 者单独诊断SPN 亦有一定的临床意义，但其效能并不理想。

单一的肿瘤标志物无法获得理想的敏感度和特异度，因此欧洲肿瘤标志物专家组亦推荐CEA、CYFRA21-1 和NSE 联合检测用于肺癌的诊断。张绍武等[11]探讨肺癌患者BALF 中CEA、CYFRA21-1、NSE 联合检测对肺癌诊断的价值，结果发现3 者联合的诊断效能均高于单一肿瘤标志物。方高洁等[18]研究亦发现，联合检测肿瘤标记物CEA、鳞状上皮细胞癌抗原（SCCA）、CYFRA21-1、NSE可有效诊断肺癌。以上结果表明，联合检测可能是提高诊断效能的一种有效的诊断方法。为提高诊断效能，本研究将BALF LCT 检测联合肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1 和NSE 用于诊断SPN。结果发现，BALF LCT 检测联合肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1和NSE的AUC、准确度、敏感度和特异度分别0.801（95%CI:0.718～0.847）、0.720（95%CI:0.718～0.722）、0.803（95%CI:0.731～0.875）、0.743（95%CI:0.705～0.822），均高于单一诊断指标。提示4 项指标联合检测可明显提高诊断效能，在良恶性SPN鉴别中发挥作用。值得注意的是，CEA、CYFRA21-1 和NSE亦可通过BALF 获得，因此一次抽样可以同时获得4项指标，表明该方法具有一定的简便性和易用性。

综上所述，本研究发现BALF LCT、CEA、CYFRA21-1及NSE在良恶性SPN存在差异，但是单独诊断SPN 的效能并不理想，BALF LCT 联合CEA、CYFRA21-1 及NSE 可以提高诊断效能，有效辅助SPN的鉴别，值得临床推广应用。但本研究为回顾性研究且样本量较小，有关结论仍需进一步验证。