短发夹RNA沉默HIPK2对口腔鳞癌SCC-25细胞株增殖、自噬和裸鼠移植瘤生长的影响*

李森森，杨再波△，朱 彬，童国勇，张宏谧

（1.湖北恩施土家族苗族自治州中心医院口腔诊疗中心，恩施 445000；2.湖北民族大学附属民大医院口腔科，恩施 445000）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常见的恶性肿瘤，占所有头颈鳞状细胞癌（HNSCC）病例的40%，通常表现为侵略性行为，经常导致局部浸润和早期淋巴结转移[1]。大多数OSCC 患者在诊断时处于晚期临床阶段，由于手术难以根治并且预后较差，OSCC 的5 年生存率＜50%[2]。约25%～50%的患者在治疗后会出现局部复发和远处转移[3]。因此，寻找可靠的生物标志物和新的分子靶点对于开发和实施OSCC患者的精准个性化治疗至关重要。

同源结构域相互作用蛋白激酶2（homeodomain-interacting protein kinase 2，HIPK2）属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员，通过参与调控基因表达对细胞周期、凋亡及衰老具有调控作用[4]。相关研究表明，HIPK2可作为抑癌基因，抑制乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌等肿瘤的发生和发展，或表达上调发挥促癌作用[5-7]。HIPK2 在OSCC 中表达升高，且以仅胞质阳性表达为主，与OSCC 的密预后密切相关[8]。但HIPK2 对OSCC 的具体作用机制尚未见相关报道，因此，本文通过构建HIPK2 短发夹RNA 沉默HIPK2 表达，探究其对OSCC 细胞SCC-25 生长、自噬及裸鼠移植瘤生长的影响。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

DMEM 培养基、胎牛血清、青—链霉素和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；人舌磷癌细胞SCC-25购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 购 自Thermo Fisher；一 抗HIPK2、c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ和Actin购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养

SCC-25 细胞置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中用高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清和1%青—链霉素）培养，每3 d更换1次培养基，收集细胞时用0.25%胰蛋白酶消化，试验选用对数生长期细胞。

1.3 细胞处理及分组

设计两对shRNA序列（HIPK2-shRNA1、HIPK2-shRNA2）干扰HIPK2 表达，取对数生长期SCC-25细胞，将细胞随机分为4组：Control组、shRNA-NC 组、HIPK2-shRNA1 组 和HIPK2-shRNA2组。Control 组不做处理，shRNA-NC 组转染shRNA-NC 阴性对照载体，HIPK2-shRNA1 组转染HIPK2-shRNA1 慢病毒载体，HIPK2-shRNA2 组转染HIPK2-shRNA2慢病毒载体。

1.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测HIPK2 mRNA水平

用Trizol法从SCC-25细胞中提取总RNA，采用PrimeScrip反转录试剂盒进行反转录成cDNA，通过SYBR Premix Ex Taq说明书配置PCR反应体系，反应条件为：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃30 s，35 个循环。以Actin为内参基因，用2-△△CT计算各目的基因相对表达量。引物序列：HIPK2-shRNA1 上游引物为5'-TGACCACTGTCCACAACCAGCCCTCAG-3'，下游引物为5'-TCGCACCGAGTAGCCAGCGTGC-3'；HIPK2-shRNA2 上游引物为5'-AGGAAGAGTAAGCAGCACCAG-3'，下游引物为5'-TGCTGATGGTGATGACACTGA-3'；Actin上游引物为5'-CGATGCCCTGAGGCTCTTT-3'，下游引物为5'-TAGTTTCATGGATGCCACAGGAT-3’。

1.5 克隆形成实验检测细胞增殖

将SCC-25 细胞接种至6 孔板，约500 个细胞每孔，按方法“1.3项”进行处理及分组，培养7 d后弃掉上清液，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min，洗净干燥后于显微镜下观察克隆形成数目，计算克隆形成率。细胞克隆形成率（%）=细胞克隆总数/接种细胞数×100%。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期细胞SCC-25细胞接种于6孔板，按方法“1.3 项”分组处理，胰酶消化吸收后，PBS 洗涤2 次，加入500 μL 缓冲液悬浮细胞，再加入5 μL磷脂酰丝氨酸蛋白混匀，最后加入碘化丙啶10 μL室温避光反应20 min 通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡。

1.7 Western blotting 检测HIPK2、c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表达

各组细胞加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA 法测定蛋白含量。SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白转移至PVDF 膜。4 ℃下加入HIPK2、c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ一抗（1∶1 000）孵育过夜，TBST清洗后加入HRP-IgG（1∶10 000），加入电化学发光显色液显色。以GAPDH 为内参，ImageJ 软件分析各组细胞目的蛋白与GAPDH比值。

1.8 裸鼠移植瘤模型的建立

20 只雄性Balb/c 裸鼠购自武汉大学动物实验中心，5 周龄，体重（20±2）g，许可证号：SCXK（鄂）2019—0004，在特定的无病原体条件下饲养。将裸鼠随机分为两组：Control 组和HIPK2-shRNA2 组，取方法“1.3 项”处理后的Control 组和HIPK2-shRNA2 组处于对数生长期的SCC-25 细胞，分别注射于裸鼠后背部靠近腋窝处皮下（1×107个/mL，0.2 mL/只）。达成瘤标准（瘤径≥0.5 cm）进行后续实验。处死所有裸鼠，称取肿瘤重量，TUNEL 染色检测细胞凋亡，免疫组化检测Caspase-3 阳性表达率，western blotting检测LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达水平。

1.9 TUNEL染色

将裸鼠肿瘤组织切片用二甲苯浸洗2 次脱蜡，每次5 min，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸洗1 次，每次3 min。参照TUNEL 凋亡试剂盒说明书，用蛋白酶K 工作液在37 ℃下封闭20 min，PBS 清洗2 次。在每个切片样本上加入TUNEL 反应液50 μL，37 ℃闭光反应60 min。用DAPI 复染10 min后荧光显微镜下观察。

1.10 免疫组化测定察Caspase-3蛋白的表达情况

取各组裸鼠肿瘤组织，常规石蜡包埋制成厚度约4 μm的切片，按免疫组化检测试剂盒说明书进行免疫组化染色，阳性表达为细胞质出现棕黄色颗粒，采用光学显微镜观察Caspase-3在肿瘤组织中的表达情况。

1.11 统计学方法

采用GraphPad Prism 9 软件对数据进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HIPK2 mRNA和蛋白表达水平

与Control 组比较，HIPK2-shRNA1 组、HIPK2-shRNA2组HIPK2 mRNA水平和蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05），见图1。

图1 HIPK2 mRNA水平和蛋白表达水平

2.2 HIPK2 短发夹RNA 对SCC-25 细胞克隆形成率的影响

与Control 组比较，HIPK2-shRNA1 组、HIPK2-shRNA2 组细胞克隆形成率明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 HIPK2短发夹RNA对SCC-25细胞克隆形成率的影响

2.3 HIPK2 短发夹RNA 对SCC-25 细胞凋亡率的影响

与Control组比较，HIPK2-shRNA1、HIPK2-shRNA2 组细胞凋亡率明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 HIPK2短发夹RNA对SCC-25细胞凋亡率的影响

2.4 HIPK2 短发夹RNA 对SCC-25 细c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

与Control组比较，HIPK2-shRNA1、HIPK2-shRNA2 组c-Myc 蛋白表达明显降低，cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2 比值显著升高（P＜0.05），见图4。

图4 HIPK2短发夹RNA对SCC-25细c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达的影响

2.5 HIPK2短发夹RNA 对SCC-25细胞Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达的影响

与Control 组比较，HIPK2-shRNA1 组、HIPK2-shRNA2 组Bcelin1、ATG7 蛋白表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 HIPK2短发夹RNA对SCC-25细胞Bcelin1、ATG7、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达的影响

2.6 HIPK2短发夹RNA 对口腔鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型的影响

与Control 组比较，HIPK2-shRNA2 组裸鼠肿瘤重量降低，Caspase-3阳性细胞数、细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高（P＜0.05），见图6。

图6 HIPK2短发夹RNA对口腔鳞状细胞癌裸鼠移植瘤模型的影响

3 讨论

OSCC发病机制复杂，涉及多种遗传因素、生活方式和代谢风险，但其具体分子机制尚不明确。因此，需要探索新的分子治疗靶点，并通过更好地阐明分子机制和功能意义来发现OSCC有效的治疗方式。

增殖能力的增强及凋亡的减弱是肿瘤细胞重要的生物学特征，也是肿瘤发生发展的重要生物学基础[9]。抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗OSCC 的有效手段。c-Myc 为原癌基因，可介导肿瘤细胞无限增殖，促进肿瘤细胞凋亡，相关研究表明，c-Myc高表达可促进OSCC的发生[10]。与细胞凋亡相关的基因Bax 升高能够诱导细胞凋亡，Bcl-2 是细胞凋亡的抑制剂，Bax/Bcl-2 比值能反应细胞凋亡状况[11]。细胞中的Caspase-3一般无活性，以procaspase-3 形式存在，其活化后剪切下游分子，进而诱导细胞凋亡[12]。Cheng等[13]研究发现，HIPK-2 表达降低可一起宫颈癌细胞凋亡增加，增殖减少。Puca 等[14]研究发现，HIPK2 可通过激活p53 抑癌基因细胞凋亡活性，从而促进乳腺癌细胞凋亡。本文研究表明，短发夹RNA沉默HIPK2表达可升高SCC-25 细胞凋亡率，可降低SCC-25 细胞克隆形成率，降低裸鼠移植瘤肿瘤重量，降低c-Myc蛋白表达水平，升高cleaved Caspase-3/Caspase-3、Bax/Bcl-2比值，升高裸鼠移植瘤肿瘤细胞Caspase-3阳性细胞数和细胞凋亡率。提示HIPK2 短发夹RNA 可抑制SCC-25细胞增殖和裸鼠移植瘤肿瘤的生长，并诱导SCC-25细胞和裸鼠移植瘤肿瘤细胞凋亡。

自噬在肿瘤的发生发展中具有促进和抑制的双重作用[15]。Beclin1基因，位于染色体17q21上，可作为抑癌基因参与大部分恶性肿瘤的发生发展，相关研究表明，Beclin1在口腔鳞癌组织中的阳性表达率显著低于癌旁组织，与肿瘤分化及淋巴结转移有关[16]。ATG7是自噬调节的重要蛋白，可通过调节多种酶的活性从而激活细胞的自噬及凋亡过程[17]。自噬蛋白LC3 可分为LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种，LC3-Ⅱ定位在双层膜和自噬体上，是自噬体的特异性标志分子，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值与自噬泡的数量呈正相关，其比值大小是判定自噬水平的高低的依据[18]。本研究发现，HIPK2 短发夹RNA 具有升高SCC-25细胞Bcelin1、ATG7 蛋白表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，升高裸鼠移植瘤肿瘤细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。提示HIPK2短发夹RNA可诱导并激活SCC-25细胞和裸鼠移植瘤肿瘤细胞自噬，促进肿瘤细胞凋亡。

综上所述，HIPK2 短发夹RNA 可抑制SCC-25细胞增殖，诱导细胞凋亡和自噬，抑制裸鼠移植瘤模型移植瘤的生长。HIPK2有望成为治疗OSCC的新靶点。