miR-154靶向调控GALNT7对人脑星形细胞瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响*

乔建新，刘 明，刘熙鹏，段升强

（河北北方学院附属第一医院神经外科，张家口 075000）

由星形胶质细胞所组成的脑星形细胞瘤是位于中枢神经系统常见的原发性肿瘤类型，在全球范围内具有极高的死亡率[1]。目前，关于星形细胞瘤的主要治疗方法是进行手术，其次是放疗法和化疗，但其预后仍不容乐观。因此，有必要找到其新的治疗方法以改善疗效[2]。

miRNA 是小的非编码单链RNA 分子，可通过与靶基因3'UTR 结合来调节基因和蛋白的表达，其失调可通过充当癌基因或抑癌基因参与癌症的发生，目前有许多研究报道称，miRNA 参与星形细胞瘤的发病机理[3]。miR-154作为miRNA的一种已被表明在脑星形细胞瘤患者血清和组织中表达显著下调，且与患者预后不良相关[4]。N-乙酰氨基半乳糖转移酶7（N-acetylgalactosaminyltransferase 7，GALNT7）作为N-乙酰-D-半乳糖胺转移酶家族的成员之一，已被报道可通过多种信号通路影响神经胶质瘤细胞增殖、转移能力[5]。miR-154 可通过抑制GALNT7 表达抑制喉鳞状细胞癌（LSCC）细胞增殖、侵袭和迁移[6]。在脑星形细胞瘤中miR-154是否发挥同样作用尚未可知。为此，本研究通过探讨miR-154 对人脑星形细胞瘤（U251）细胞的增殖、迁移及侵袭的影响，以期为人脑星形细胞瘤新的靶向治疗机制研究提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

胎牛血清、人脑星形细胞瘤U87、U251 细胞、pmirGLO 质粒、DMEM 培养基（货号：164210-500、YCL-0238、YCL-0237、E1330、PM150210）购自武汉益普生物科技有限公司；人脑星形细胞瘤SHG44细胞（货号：CL-0207）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；HEB 人脑胶质细胞（货号：YS2890C）购自上海雅吉生物科技有限公司；Lipofectamine™2000 Transfection Reagent（货号：11668027）购自赛默飞世尔科技；Matrigel胶（货号：356234）购自上海善然生物科技有限公司；即用型荧光定量PCR 试剂盒（货号：XY-TE-0731）购自上海烜雅生物科技有限公司；总RNA 提取试剂盒（货号：AR1200-100T）购自上海吉至生化科技有限公司；QIAGEN 反转录试剂盒（货号：QIAGEN）购自上海科敏生物科技有限公司；青霉素—链霉素（货号：LM1200K）购自上海联迈生物工程有限公司；胰酶溶液（货号：PYG0065）购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗人β-actin、GALNT7、c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2 抗体（货号：ab8227、ab97645、ab32072、ab16663、ab76003、ab37150）购自abcam；MTT 检测试剂盒、BCA 蛋白检测试剂盒、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗抗体（货号：BTN111105、K12862、WE0381-QAN）购自北京百奥莱博科技有限公司；蛋白提取试剂盒（货号：CD-13559-ML）购自武汉纯度生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号：11402ES60）购自上海翊圣生物科技有限公司；无关序列miR-NC、miR-154 mimics由赛默飞世尔科技合成。QuantStudio 3&5实时荧光定量PCR（RT-qPCR）系统、iBright 蛋白免疫印迹成像系统购自赛默飞世尔科技；CytoFLEX 流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞与培养

人脑星形细胞瘤U87、U251、SHG44 细胞及HEB人脑胶质细胞接种到DMEM培养基（10%胎牛血清）中后均置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。培养基两天更换1 次，直至细胞融合至80%左右后用胰酶消化进行传代培养。

1.2.2 RT-qPCR检测各细胞株中miR-154的表达

用RNA 提取试剂盒提取U87、U251、SHG44 及HEB 细胞中总RNA 并反转录成cDNA 后通过RTqPCR检测细胞株中miR-154表达水平。U6为内参并对mRNA 进行标准化，2-ΔΔCt分析miR-154 表达水平（n=5）。引物由Oligo 7 和Primer 3.0 软件设计（表1），送生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。

表1 RT-qPCR引物

1.2.3 细胞瞬时转染

设置对照组，将对数生长期U251 细胞（1 mL）以2×105个/mL接种于6孔板中培养至细胞贴壁后，每组设置6 个复孔，按Lipofectamine™2000 说明书以终浓度为5 nmol/L分别将miR-NC、miR-154 mimics转入相应组U251细胞中培养48 h。

1.2.4 MTT法检测细胞活力

设置对照组、miR-NC组、miR-154 mimics组，细胞转染后以1×105个/孔的密度，重复5孔，每孔100 μL，在96孔板中培养至对数生长期。添加MTT 10 μL/孔（5 g/L），4 h后弃上清培养液加入DMSO 100 μL，震荡至MTT 反应结晶充分溶解后，在570 nm 处测定吸光度OD值，计算U251细胞存活率（%）=（OD处理组/OD对照组）×100%。

1.2.5 平板克隆法检测U251细胞增殖情况

各组U251细胞经0.25%胰酶消化，DMEM培养基（10%胎牛血清）终止消化后制备悬浮液并转至培养皿中培养，直至克隆细胞肉眼可见，弃上清后15 min 多聚甲醛固定，20 min 结晶紫溶液（1%）染色，流水冲洗晾干后计数（n=5），克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.2.6 Transwell法检测U251细胞侵袭和迁移能力

侵袭实验：用无血清DMEM培养基按1∶8稀释4 ℃过夜融化的Matrigel（50 mg/L）胶后，包被Transwell小室上室，37 ℃过夜孵育1 h后将各组U251细胞调整浓度为2.5×105个/mL，取200 μL接种于小室上室，并在下室加入DMEM培养基500 μL培养24 h后PBS清洗，棉签擦去上室未穿膜细胞，进行30 min甲醇固定、30 min 结晶紫溶液（0.1%）染色，随机选取5 个视野内观察穿膜细胞并计数。迁移：使用未被Matrigel 胶所包被的上室，除此之外与侵袭实验相同。

1.2.7 双荧光素酶报告基因检测miR-154 与GALNT7的靶向关系

通过TargetScan(http://www.Targetscan.org/)确定miR-154与GALNT7结合位点后验证二者靶向关系。将与miR-154 靶向序列相结合的GALNT7 的3'-UTR 片段经扩增、酶切和连接后，构建野生型和突 变 型GALNT7 载 体：pmirGLO-GALNT7-wt 和pmirGLO-GALNT7-mut。将接种于96 孔板的对数生长期U251细胞分为pmirGLO-GALNT7-wt+miR-154 mimics 组、pmirGLO-GALNT7-wt+miR-NC 组以及pmirGLO-GALNT7-mut+miR-154 mimics 组、pmirGLO-GALNT7-mut+miR-NC 组。按Lipofectamine™2000 说明书分别对各组细胞进行转染48 h 后，使用双重荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性：分别添加报告基因细胞裂解液（200 μL）和荧光素酶反应液（50 μL）检测荧光强度A 后再加入反应终止液对荧光强度B 检测进行，荧光素酶相对活性：A/B。

1.2.8 Western blotting 检测U251 细胞中蛋白表达情况

使用RIPA 裂解液对U251 细胞进行裂解后，用BCA 蛋白试剂盒测定各组细胞总蛋白含量；SDSPAGE 电泳分离蛋白、低温转至PVDF 膜上，脱脂奶粉进行为时1 h的封闭，加入兔抗β-actin、GALNT7、c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2（1∶1 000）一抗孵育（4 ℃）过夜后再用二抗（1∶5 000）孵育2 h，蛋白凝胶成像仪定量分析各蛋白含量（n=5）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验，多组件比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-154在人脑星形细胞瘤U87、U251、SHG44细胞及HEB人脑胶质细胞中的表达情况

与HEB人脑胶质细胞（0.99±0.12）相比，人脑星形细胞瘤U251、U87、SHG44 细胞中miR-154 表达水平均显著降低（0.35±0.09、0.56±0.11、0.61±0.10），并且在U251 细胞中其表达量最低（F=31.880，P＜0.001）（图1），因此选择U251细胞进行以下实验。

图1 miR-154在各细胞株中的表达情况

2.2 miR-154转染效率检测

与对照组比较，miR-NC 组U251 细胞中miR-154 表达水平无显著变化（P＞0.05），miR-154 mimics 组其表达水平显著增加（P＜0.05）（表2）。通过荧光显微镜观察U251细胞转染效果，见图2。

表2 各组U251细胞中miR-154的表达水平比较n=5，

表2 各组U251细胞中miR-154的表达水平比较n=5，

与对照组比较，*P＜0.05。

图2 荧光显微镜观察结果（×200）

2.3 MTT法检测miR-154对U251细胞增殖的影响

与对照组比较，miR-NC 组U251 细胞存活率无明显变化（P＞0.05），miR-154 mimics组细胞存活率显著降低（P＜0.05），见表3。

表3 各组U251细胞存活率比较n=5，

表3 各组U251细胞存活率比较n=5，

与对照组比较，*P＜0.05。

2.4 平板克隆法检测miR-154 对U251 细胞增殖的影响

与对照组比较，miR-NC 组U251 细胞克隆数无明显变化（P＞0.05），miR-154 mimics组细胞克隆数显著降低（P＜0.05），见表4，图3。

表4 各组U251细胞克隆数比较n=5，

表4 各组U251细胞克隆数比较n=5，

与对照组比较，*P＜0.05。

图3 miR-154对U251细胞增殖的影响

2.5 miR-154对U251细胞侵袭迁移的影响

与对照组比较，miR-NC 组U251 细胞侵袭和迁移数无明显变化（P＞0.05），miR-154 mimics组细胞侵袭和迁移数显著减少（P＜0.05），见表5，图4。

表5 各组U251细胞侵袭、迁移情况比较n=5，

表5 各组U251细胞侵袭、迁移情况比较n=5，

与对照组比较，*P＜0.05。

2.6 miR-154对U251细胞内增殖、侵袭和迁移相关蛋白的影响

与对照组比较，miR-NC组U251细胞内c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2表达水平无明显变化（P＞0.05），而在miR-154 mimics组其表达水平显著降低（P＜0.05），见表6，图4。

表6 各组U251细胞内增殖、侵袭和迁移相关蛋白的比较n=5，

表6 各组U251细胞内增殖、侵袭和迁移相关蛋白的比较n=5，

与对照组比较，*P＜0.05。

图4 miR-154对U251细胞侵袭迁移的影响

2.7 U251 细胞中miR-154 与GALNT7 间的靶向关系

Http://microRNA.org 预测结果显示出miR-154与GALNT7 间具有结合位点，GALNT7 是miR-154的潜在靶基因（图6）。荧光素酶报告基因结果显示：与pmirGLO-GALNT7-wt+miR-NC 组相比，pmirGLO-GALNT7-wt+miR-154 mimics 组荧光素酶活性显著降低（t=5.890，P＜0.01）；其余组荧光素酶活性差异无统计学意义（t=0.234，P＞0.05）（图7）。与对照组比较，NC 组GALNT7 表达水平无明显变化（P＞0.05），miR-154 mimics组GALNT7表达水平显著降低（P＜0.05），见表7、图8。

表7 各组GALNT7蛋白表达水平比较n=5，

表7 各组GALNT7蛋白表达水平比较n=5，

与对照组比较，*P＜0.05。

图5 miR-154对各组U251细胞内c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2表达水平的影响

图6 miR-154与GALNT7结合位点

图7 荧光素酶活性检测结果

图8 miR-154对GALNT7蛋白表达的影响

3 讨论

星形细胞瘤是中枢神经系统中最为常见的一种具有高侵袭性的高度恶性脑肿瘤，其源自于中枢神经系统的星形胶质细胞，占原发性脑肿瘤的60%以上，并且其早期体征和症状为非特异性[7-9]。目前针对星形细胞瘤治疗的疗效十分有限，而且由于当前治疗的非特异性靶向性质，患者普遍复发率很高，因此，随着现代科学技术的进步和医学手段的提高，靶向治疗越来越得到医学工作者的重视[10]。

miRNA作为非编码RNA已被证明参与癌症的发生发展，并且越来越多的研究表明，miRNA 在癌症发生过程中的重要性及其作为癌症良好治疗靶标的 适 用 性[10]。miR-101[11]、miR-128[12]、miR-224-3p[13]、miR-154[4]等多种miRNA被发现参与星形细胞瘤的发生发展。在星形细胞瘤患者组织和血清中miR-154 表达显著降低，并且高表达患者预后较为良好，其低表达可能与星形细胞瘤的发生发展有关，且对该疾病具有一定诊断和预后评估的价值[4]。miR-154已被发现参与乳腺癌[14]、胶质母细胞瘤[15]等多种类型癌症的发生发展过程，并且在其中表达异常降低。研究发现，miR-154-5p通过靶向抑制PIWI 样蛋白1（Piwi-like protein 1，PIWIL1）表达来抑制胶质母细胞瘤的增殖和转移[15]。miR-154通过靶向抑制Wnt5a表达而具有作为胶质母细胞瘤抑制因子的作用。本研究发现，miR-154 在星形细胞瘤U251细胞中表达水平均显著降低，miR-154过表达可显著抑制细胞存活率、细胞克隆数、侵袭和迁移数、c-Myc、CyclinD1、MMP9、MMP2表达水平，结果表明，miR-154过表达可显著抑制U251细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

GALNT7 作为GALNT 家族成员之一，可调节癌细胞与细胞外环境的相互作用，其在宫颈癌[16]、结直肠癌[17]等多种类型的恶性肿瘤中表达上调，表明GALNT7参与肿瘤的发生，抑制其表达可使肿瘤消退[16]。LncRNA TP73-AS1 沉默可抑制神经胶质瘤细胞的增殖，促进其死亡，而外源性GALNT7 可逆转TP73-AS1 对胶质瘤细胞增殖抑制的作用[18]。有几项研究也表明，miR-125a-5p[15]、miRNA-30e[19]等多种miRNA 的可靶向调节GALNT7 的表达，在宫颈癌中miR-125a-5p 通过抑制EGFR/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（EGFR/ PI3K/AKT）途径激活来使GALNT7表达下调，从而抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭[16]。在LSCC中，miR-154可通过抑制GALNT7表达抑制LSCC细胞增殖、侵袭和迁移[6]。本研究靶基因预测结果显示，GALNT7 是miR-154 的潜在靶基因，与pmirGLO-GALNT7-wt+miR-NC 组相比，pmirGLO-GALNT7-wt+miR-154 mimics组荧光素酶活性显著降低，并且miR-154 mimics组GALNT7表达水平显著降低。结果表明，miR-154 过表达对U251 细胞增殖、侵袭和迁移的抑制可能与抑制GALNT7表达有关。

综上所述，miR-154 过表达通过靶向抑制GALNT7 表达来抑制U251 细胞增殖、侵袭和迁移能力。本研究不仅对星形细胞瘤的新的靶向治疗机制的研究具有重要价值，还为miR-154 在星形细胞瘤中的作用机制研究提供了参考，但在未来的研究中还需要对其下游通路进行研究，使其机制研究更为完善。