甘蔗叶多糖对大鼠心肌梗死后心肌纤维化的影响*

刘 丹，林 锟，侯小涛，何 涛Δ

（1.湖南省人民医院星沙院区，长沙 410000；2.广西医科大学第一附属医院，南宁 530021；3.广西中医药大学药学院，南宁 530001）

心肌梗死是一种临床常见危重症，具有高致残率和致死率。心肌梗死后心肌纤维化是心肌组织对缺血刺激产生的一种自我修复的过程[1]。在心肌梗死早期可形成瘢痕，防止心脏破裂，但后期随着细胞外基质过度蓄积，无收缩功能的瘢痕组织替代受损的心肌，心室顺应性下降[2]，最终发展为心力衰竭。因此，如何有效减轻心肌间质纤维化是防治心肌梗死后心衰的重要策略。有研究显示，心肌纤维化的发生、发展受多种基因及蛋白的调控，其中细胞因子TGF-β1、NF-κB 及ERK1/2 与心肌纤维化密切相关[3-4]，其在刺激细胞外基质的合成、促进心肌成纤维细胞分泌胶原蛋白等效应中发挥重要作用[5]。本课题组前期研究发现，甘蔗叶多糖能促进梗死区周围心肌组织的血管内皮生长因子（VEGF）的表达[6]，对缺血心肌有一定的保护作用。此外，甘蔗叶多糖药效研究显示，其具有抗炎、抗氧化、抗自由基等作用[7]，能减轻炎症反应，而炎症反应在心肌纤维化的发生发展中起着十分重要的作用。为明确甘蔗叶多糖能否减轻大鼠心肌梗死后心肌纤维化，本研究通过结扎大鼠冠状动脉左前降支建立心肌梗死模型，检测心肌梗死后心肌纤维化的程度及上述相关因子的表达，探讨甘蔗叶多糖对大鼠心肌梗死后心肌纤维化可能的调控机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性8周龄SD大鼠26只，体重(230±20)g，由广西医科大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK(桂）2014-0002。

1.2 材料和试剂 甘蔗叶多糖（广西中医药大学侯小涛老师课题组提供）；Ⅰ型胶原抗体（博奥森公司，bs-0578R）；Ⅲ型胶原抗体（博奥森公司，bs-0549R）；通用SP试剂盒（北京中杉桥生物技术有限公司）；Trizol Reagent（美国赛默飞世尔科技公司）；逆转录试剂盒（大连宝生物，RR036A；荧光定量试剂盒（大连宝生物，RR820A）；引物合成（上海生工）；磷酸酶抑制（Roche 公司）；一抗、二抗稀释液（武汉博士德公司，AR1017）；兔一抗p44/42 MAPK(ERK1/2)（美国CST 公司）；兔一抗Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)（美国CST 公司）；兔一抗GAPDH（美国CST 公司）；二抗羊抗兔IgG（英国Abcam，ab97051）。

1.3 主要仪器 动物呼吸机（上海奥尔特生物科技有限公司，ALC-V9）；心电图机（日本福田公司，FCP-2155）；PCR 仪（美国Bio-Rad，CFX connect）；ECL 化学发光成像仪（美国ProteinSimple，FliorChem HD2）；超声波细胞破碎仪（美国SONICS）；蛋白印迹电泳、转膜系统（美国Bio-Rad）；正置荧光显微镜（OLYMPUS，BX53）。

1.4 大鼠心梗模型的制备、分组及给药 26只健康SD 大鼠参照文献结扎冠状动脉左前降支制备大鼠心肌梗死模型[8]。结扎前后分别记录心电图，造模成功的标准：结扎后肢导ST段较结扎前抬高。将造模成功后大鼠随机分为模型组（MI 组）、处理组（SLP组），另设假手术组（Sham组），Sham组只穿线未予结扎。造模后第1 天开始，各组分别进行灌胃处理，SLP组灌入甘蔗叶多糖溶液（4 g/L），按1 mL/100 g 大鼠体重给药，MI 组及Sham 组灌入等量的0.9%生理盐水，连续4周。

1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测NF-κB、TGF-β1 mRNA 表达 各组大鼠心肌梗死4 周后梗死周边区组织中，取50 mg 左右梗死周边区心肌组织，剪碎、超声匀浆后采用Trizol 法提取RNA，经PrimeScriptTMRT Master 试剂盒反转录成cDNA，Ta-KaRa SYBR ExScript RT-PCR Kit 进行qPCR 反应，GAPDH 为相对定量参照物，2-△△CT计算基因表达水平。GAPDH 上游序列：5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'，下游：5'-G ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'；TGF-β1 上游序列：5'-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3'，下游：5'-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3'；NF-κB 上游序列：5'-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3'，下游：5'-TCCGGAACACAATGG CCAC-3'。

1.6 Western blotting检测p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表达 各组大鼠心肌梗死4 周后梗死周边区组织中，取50 mg左右梗死周边区心肌组织，剪碎后经超声匀浆破碎后提取蛋白。经电泳、转膜、孵育一抗(GAPDH、ERK、p-ERK均为1∶1 000)、二抗（1∶5 000）、ECL 化学发光底物显色后，使用FliorChem HD2 成像系统（ProteinSimple）观察，DRAFT-alphaview 计算图像条带灰度值，计算P-ERK1/2/ERK1/2 蛋白相对表达。

1.7 大鼠心肌结缔组织染色 取梗死周边区心肌组织，经4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋制成切片，光学显微镜下观察，Masson染色检测梗死边缘区心肌间质纤维化的程度，正常的心肌纤维被染成红色，纤维化的胶原纤维被染成蓝色，细胞核则染成黑蓝色，纤维化程度用胶原容积分数(CVF)（CVF=胶原面积/所测视野面积）表示。免疫组化观察梗死周边区Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达情况，阳性为梗死边缘区心肌间质着色棕色或棕黄色的片状区域，阳性反应强度用MIOD（MIOD=IOD/AOI）表示，阳性反应强度与Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达量呈正相关关系。每张切片在10×40倍视野下随机选取5个视野，采用Image-pro plus 6.0 软件分别计算每张切片的CVF、MIOD。

1.8 统计学方法 采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用LSD 与SNK 检验，方差不齐时，多组间均数比较则采用Welch 分析；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死4 周后梗死周边区NF-κB、TGF-β1mRNA 和p-ERK1/2/ ERK1/2 的表达 各组大鼠心肌梗死4 周后梗死周边区TGF-β1、NF-κB mRNA 和p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白均表达。与Sham组相比，MI 组TGF-β1、NF-κB mRNA 表达明显增加，而SLP组中TGF-β1、NF-κB mRNA表达较MI组显著降低（均P＜0.05）。与Sham 组相比，MI 组、SLP 组中p-ERK1/2/ERK1/2 蛋白表达显著增加，而SLP 组中p-ERK1/2/ERK1/2 较MI 组表达明显降低（均P＜0.05），见表1，图1。

表1 各组大鼠心肌梗死边缘区组织TGF-β1、NF-κB mRNA和p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表达

图1 各组大鼠心肌梗死周边区组织p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表达水平的比较

2.2 各组MASSON染色结果及心肌梗死周边区心肌间质的胶原容积分数比较 光学显微镜下，Sham组心肌无纤维化现象，均为正常的心肌纤维，未见纤维化的胶原纤维；MI组和SLP组均有心肌纤维化现象，SLP 组纤维化较MI 组明显减轻（图2）。与Sham 组比较，SLP 组和MI 组CVF 显著升高（P＜0.05），与MI 组比较，SLP 组CVF 明显降低（P＜0.05），见表2。

图2 各组MASSON染色结果比较（×400）

表2 各组大鼠心肌梗死周边区心肌间质的胶原容积分数比较

2.3 各组大鼠心肌梗死4 周后梗死周边区心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达 光学显微镜下观察显示，Sham组未见Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达；而SLP组和MI 组梗死周边区心肌间质内均可见被染成棕色片状的Ⅰ型胶原蛋白及棕黄色斑片状散在分布Ⅲ型胶原蛋白；SLP组Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白表达较MI组明显减少（图3、图4）。SLP组和MI组梗死周边区心肌间质均有Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白表达，与Sham组比较，Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白的MIOD 明显升高（P＜0.05），而与MI 组比较，SLP 组Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白的MIOD显著降低（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠心肌梗死4 周后心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的结果

图3 免疫组化测各组大鼠心肌梗死4周后梗死边缘区Ⅰ型胶原蛋白（×400）

图4 免疫组化测各组大鼠心肌梗死4周后梗死周边区Ⅲ型胶原蛋白（×400）

3 讨论

心肌梗死后心肌纤维化是心衰、恶性心律失常、心源性猝死等心血管疾病发生发展的重要病理、生理基础，如何有效的减轻心肌梗死后心肌纤维化是防治上述并发症发生、发展的重要靶点。

心肌纤维化涉及一系列复杂细胞因子及多种基因和蛋白的激活、表达与调控。有研究显示，TGF-β1 是引起纤维化最重要的细胞因子，TGF-β1可促进心肌成纤维细胞增殖分化为肌成纤维细胞，并可诱导Smad2/3的激活[9]，导致细胞外基质合成与降解间动态平衡被打破[10]，加速心肌纤维化形成。有研究发现，下调TGF-β1 表达可从多途径减轻心肌纤维化[11]。此外，炎症因子的水平与心肌纤维化的程度密切相关，有研究显示，抑制NF-κB 信号通路激活减少梗死心肌组织中促炎性细胞因子（TNFα，IL-1β 和IL-6）的生成[12]，减轻炎性细胞因子对心成纤维细胞的刺激作用，减少心肌间质胶原蛋白的合成，从而减轻小鼠心肌梗死后的炎症反应和心肌纤维化。

甘蔗是属于禾本科甘蔗属的植物，甘蔗叶中含有黄酮类、有机酸、多酚、维生素、甘蔗多糖等多种化学成分[7]，其中多糖在抗氧化、抗炎、加强免疫、降血糖等方面发挥着重要作用[7]。有研究报道，当归多糖通过抑制MAPK/NF-κB通路，减少心肌梗死后高浓度炎性因子如TNF-α、IL-1β和IL-6 的生成[13]，从而减轻炎症反应，延缓心肌梗死后心肌纤维化进程。本实验结果显示，甘蔗叶多糖能抑制TGF-β1、NF-κB mRNA 的表达（均P＜0.05），提示甘蔗叶多糖减少心梗后心肌纤维化可能与抑制促纤维化基因TGF-β1、NF-κB mRNA的表达有关。

此外，ERK1/2信号通路在调节成纤维细胞增殖及间质纤维化中有重要的生物学功能[4]。有研究表明，磷酸化ERK1/2可以上调miR-21的表达，增强心肌成纤维细胞的增殖、分化[14]，从而导致心肌细胞外基质蓄积，引起心肌间质纤维化，而下调p-ERK1/2/ERK1/2 的表达，可减轻心肌纤维化[15]。本研究发现，甘蔗叶多糖能下调p-ERK1/2/ERK1/2的表达（均P＜0.05），表明甘蔗叶多糖减少心肌梗死后心肌纤维化，亦可能与下调p-ERK1/2/ERK1/2的表达相关。

既往研究表明，Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白是心肌间质的主要成分，其中Ⅰ型胶原与心肌舒张收缩的僵硬度有关，Ⅲ型胶原与室壁弹力有关，Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的合成增加，降解减少及合成与降解失衡，是心肌纤维化主要发病机制[16]。本研究Masson 染色结果发现，甘蔗叶多糖能明显减少心肌间质的CVF，而免疫组化结果同样表明甘蔗叶多糖能明显减少心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达（均P＜0.05），表明甘蔗叶多糖能减少心肌梗死后心肌细胞外基质过度蓄积，减轻心肌梗死后心肌纤维化。

总之，甘蔗叶多糖能减轻大鼠心肌梗死后梗死边缘区心肌间质纤维化，其机制可能与抑制促纤维化基因TGF-β1、NFκ-B mRNA的表达，下调p-ERK1/2/ERK1/2蛋白的表达有关。