一株产红色素的壮观链霉菌分离鉴定及其发酵条件优化
2021-12-17蔡婉瑶蒲佳琳葛雯廖淑敏张卉
蔡婉瑶 蒲佳琳 葛雯 廖淑敏 张卉
摘要：从5个地区采集样本，对样本分离筛选后，利用形态学鉴定和16SrDNA序列分析构建系统进化树，筛选出1株产红色素的壮观链霉菌AX-3。利用单因素和正交试验确定菌株的最佳发酵配方为：可溶性淀粉2%、甘油2%、硝酸钾0.2%、磷酸氢二钾0.02%、氯化镁0.02%、氯化钠0.01%。
关键词：链霉菌;天然色素;正交试验;红色素;发酵优化
中图分类号：TQ920.6 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2021）06-0059-04
色素广泛应用于食品、医药、纺织等领域。近年来，国内外研究发現合成色素具有一定的毒性和致癌性，使得开发安全性更高的天然色素成为新趋势。微生物源色素具有不受季节和环境限制、生产周期短等优点，应用前景广阔。从自然界分离的色素微生物产量低，性质不稳定。从土壤分离得到1株产红色素的链霉菌AX-3，对该菌株进行形态学和分子生物学鉴定，明确其分类地位，并通过正交试验优化其产色素条件，旨在提高色素产量和降低发酵成本，为该色素的产业化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株来源 土壤样本采集自西安市秦岭山地、鞍山市岫岩花园、大连市甘井子区、三明市泰宁县、辽阳市牛犋村共5个地区。
1.1.2 培养基 PDA培养基，NA培养基，高氏一号培养基。种子培养基和发酵培养基：参照朱运平方法。
1.2 菌株的分离和纯化
分别利用高氏一号培养基、PDA培养基和NA培养基，采用稀释涂布平板法分离样品中的微生物，于28 ℃倒置培养7 d后，再于37 ℃倒置培养2 d。挑取带颜色的单菌落进行划线纯化。将纯化后的链霉菌AX-3接种于高氏斜面培养基中培养并保藏。
1.3 菌株AX-3的鉴定
1.3.1 形态鉴定 观察菌株AX-3在高氏一号培养基的菌落形态，并利用扫描电镜观察菌丝孢子形态特征和排列。
1.3.2 分子生物学鉴定 常规方法提取AX-3菌株DNA，采用放线菌通用引物进行PCR扩增，并将PCR扩增产物送至华大基因公司测序。通过NCBI进行BLAST比对，分别采用MEGA7.0软件和Neighbor-Joining方法进行序列分析和构建系统发育树。
1.4 色素提取
取发酵液10 000 r/min离心10 min，沉淀用无菌水洗涤3次，收集菌体。乙酸乙酯与菌体20︰1混悬，超声处理后10 000 r/min离心10 min，得到色素溶液，在467 nm测定吸光度。
1.5 单因素试验
1.5.1 碳源优化 以相同浓度的玉米粉、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、甘油和葡萄糖（1︰1）、甘油和可溶性淀粉（1︰1）作为发酵培养基中的碳源，其他条件不变。
培养测定条件为：装液量50 mL/250 mL，接种量10%，于28 ℃、180 r/min条件下发酵7 d后，取发酵液离心测定色素含量。每个处理3个重复。
1.5.2 氮源优化 分别以相同浓度的硝酸钾、酵母浸膏、硝酸铵、酵母浸膏和硝酸铵（1︰1）、氯化铵作为发酵培养基的氮源，碳源为甘油和可溶性淀粉，其他条件不变。培养测定条件同1.5.1。
1.5.3 温度优化 分别设定发酵温度为22，25，28，31，
34 ℃，在可溶性淀粉1%、甘油1%、硝酸钾0.1%、磷酸氢二钾0.02%、氯化镁0.02%、氯化钠0.01%的培养基培养。培养测定条件同1.5.1。
1.6 正交试验
根据单因素试验结果，选取筛选出最佳碳源、氮源3个因素，分别取3个水平进行L9（33）正交试验，每个处理3个重复，因素设计见表1。
1.7 数据处理与分析
试验数据采用SPSS 25.0进行分析。
2 结果与分析
2.1 链霉菌AX-3的分离及筛选结果
将15株土样通过稀释涂布平板法培养，获得9株有颜色的土壤菌株，如表2所示。对这些菌株进行平板划线分离，获得2株颜色鲜艳的土壤放线菌，分别为红色放线菌和黄色放线菌。对这两株土壤放线菌进行复筛，发现红色放线菌长势更好，因此选定链霉菌AX-3进行后续研究。
2.2 链霉菌AX-3鉴定
经鉴定，菌株AX-3为壮观链霉菌（Streptomyces spectabilis），其形态特征和扫描电镜观察如图1所示。其菌落呈圆形，中间有突起，气生菌丝为红色。孢子丝连在一起，呈网状，且表面粗糙。链霉菌AX-3的系统发育树如图2所示。
2.3 碳源种类对链霉菌AX-3的影响
不同碳源对色素产量的影响见图3。
结果表明：在相同培养时间内，不同碳源对色素产量的影响不同，甘油和可溶性淀粉作为碳源时链霉菌AX-3色素产量最大，甘油次之。菌种对这2种碳源利用效果最好，因而选择甘油和可溶性淀粉作为碳源。
2.4 氮源种类对链霉菌AX-3的影响
在最佳碳源培养基中分别添不同氮源作为唯一氮源，对色素产量的影响如图4所示。
结果表明，在相同培养时间内，几种氮源对色素产量的影响不同。硝酸钾作为氮源时，链霉菌色素产量最高，因此选择硝酸钾作为氮源。
2.5 发酵温度对链霉菌AX-3的影响
温度对色素产量的影响如图5所示。
结果表明：温度为22～28 ℃时，温度升高有利于生长代谢和色素产生，色素含量逐渐增加;当温度为28 ℃时，培养菌体产生的色素含量较高;温度为28～34 ℃时，随着温度升高代谢速度随之下降，影响菌体正常生长，导致色素含量降低。因此，选择28 ℃作为发酵培养温度。
2.6 正交试验分析
由表3—4可以看出：3个因素中有2个对菌体色素产量有明显影响;由极差分析结果确定C>B>A，即硝酸钾>甘油>可溶性淀粉;菌体发酵产色素的最高组合为可溶性淀粉2%、甘油2%、硝酸钾0.02%。在此条件下，测得色素OD467值为0.524。综合分析，选取菌体发酵产色素的最佳组合为A2B2C2。
3 结论
从辽宁鞍山岫岩花园土中分离筛选一株产红色素的链霉菌AX-3，鉴定为壮观链霉菌属（Streptomyces
spectabilis）。在单因素试验的基础上，采用正交试验优化该菌株产红色素的发酵条件，得出最佳发酵培养基组分为：可溶性淀粉2%、甘油2 %、硝酸钾0.2%、磷酸氢二钾0.02%、氯化镁0.02%、氯化钠0.01%。
试验数据可为该菌株所产红色素的分离纯化、组分分析等方面提供试验依据，也为色素在食品、化妆品等行业中的开发利用提供理论依据。目前，对链霉菌AX-3分子量、化学式等尚不了解，今后应开展对色素组分分离和结构鉴定的研究。
参考文献
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Isolation and Identification of a Red Pigment Producing Streptomyces
Spectabilis and Optimization of Fermentation Conditions
CAI Wanyao， PU Jialin， GE Wen， LIAO Shumin， ZHANG Hui*
（College of Pharmaceutical and Biological Engineering Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang 110142， China）
Abstract： Samples were collected from five regions and after sample isolation and screening， a phylogenetic tree was constructed using morphological identification and 16SrDNA sequence analysis to screen one red pigment Streptomyces spectabilis AX-3. The best fermentation formula of the strains was determined by single factor and orthogonal tests： Soluble starch 2%， glycerol 2%， potassium nitrate 0.2%， potassium bisphosphate 0.02%， magnesium chloride 0.02% and sodium chloride 0.01% .
Key words： streptomycete; natural pigment; orthogonal test; red pigment; fermentation optimization
收稿日期：2021-10-12
基金項目：沈阳化工大学创新创业大赛国家级项目（202010149018）
作者简介：蔡婉瑶（2000—），女，从事生物工程方面的研究。
通信作者：张 卉（1968—），女，博士，副教授，从事天然产物的研究与开发。
