中草药源杀菌剂“轮纹一扫光”对苹果枝干轮纹病防治作用研究

张 杰，刘媛媛，朱会营，王新茹，李 艳，李会平,3*

（1. 河北农业大学林学院，保定 071001；2. 天域生态环境股份有限公司，上海 200082；3. 河北省城市森林健康技术创新中心，保定 071001）

苹果轮纹病是苹果的主要病害之一，对全球主要苹果产区的苹果生产产量和果品质量都产生重大影响[1]。近年来，苹果轮纹病在我国多个省市的苹果种植园内大面积发生，并有日益严重的趋势[2]。

目前，苹果轮纹病的防治主要以化学防治为主。李晶等[3]通过研究10种杀菌剂对苹果轮纹病菌的室内毒力测定表明，50%多菌灵可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂和 10%世高水分散粒剂对苹果轮纹病菌的毒力较强。张林尧等[4]研究出生物菌剂 LZ-1对已发生枝干轮纹病的树体具有较高的防治效果,最高防效可达89.93%，与甲基硫菌灵化学涂剂处于同一水平。Fan等[5]研究表明，当每公顷200～250 g活性成分的吡唑醚菌酯用作治疗性或预防性杀菌剂时，对苹果轮纹病的防治效果超过 80%。Song等[6]通过不同作用方式评估杀菌剂对苹果轮纹病的敏感性和防治作用，表明咯菌腈、氟啶胺和嘧啶恶唑对苹果轮纹病有很大的防治潜力。三唑类杀菌剂10%苯醚甲环唑WG和430 g/L戊唑醇SC对轮纹病的防治效果均较好[7]。唐兴敏等[8]通过选取生产上常用的6种铜制剂采用载玻片孢子萌发法测定了不同铜制剂对苹果轮纹病菌分生孢子萌发抑制作用筛选出倍量式波尔多液、硫酸铜和松脂酸铜是抑制苹果轮纹病菌分生孢子萌发最好的药剂。戊唑·多菌灵·乙膦铝乳胶液对苹果枝干轮纹病的防治效果显著高于同种药剂的水溶液[9]。0.3%树安康可湿性粉剂铲除粗皮型和病瘤型苹果枝干轮纹病的最佳浓度为40倍液，通过涂抹或者喷施12次后防治效果在80%以上，因此可作为田间防治苹果枝干轮纹病的有效药剂[10]。合理的农药混配对病害具有明显的增效作用。18%烯肟菌酯·氟环唑SC 90～120 mg a.i./kg处理剂量对苹果斑点落叶病、苹果白粉病和苹果轮纹病的防效均在85%以上，防效优于生产常规使用药剂50%多菌灵WP、12.5% 腈菌唑EC、15%三唑酮WP的效果[11]。烯肟菌酯与咪鲜胺在3:1、1:1、1:3、1:5、1:7配比下对苹果轮纹病增效作用明显[12]。张伟等[13]通过室内外以及田间试验结果表明, 苯醚甲环唑与克菌丹混配制剂可作为防治苹果轮纹病的农药，当两者的有效成分配比为1:2至1:8时均表现增效作用，其中有效成分1:4为最佳配比。近年来，对苹果枝干轮纹病的防治，因化学农药具有高防效、低成本、适用范围广等优点，生产上主要以化学防治为主，但也存在农药残留造成环境污染、影响果品质量等一系列弊端。

植物源杀菌剂是一类利用一些植物含有的某些抗菌物质或诱导产生的植物防卫素，杀死或抑制病原菌的生长，具有高效、低毒或无毒、易降解、选择性高、不产生抗药性等优点[14]。中草药源杀菌剂属于其中的一种，对有害生物高效，对非靶标生物安全，易分解且分解产物对环境无害即一种“环境和谐农药”[15]。李峰等[16]研究表明，中药虎杖提取物白藜芦醇对核桃黑斑病菌有抑制作用，有望为核桃黑斑病的防治开发出合适的植物源杀菌剂。蛇床子素是从蛇床子种子中提取的杀菌活性物质，能够影响病原真菌细胞壁生长，抑制菌丝生长。蒋晶晶等[17]测定了蛇床子素对向日葵菌核病、西瓜蔓枯病、葡萄灰霉病等6种病害病原菌的毒力，发现均起到不同程度的抑制作用，其中对向日葵菌核病病原菌毒力最强。丁子香酚是从丁香、百部等中药材中提取溶菌性化合物，辅以助剂研制成的植物源低毒杀菌剂，具有广谱、高效、安全的特性，对苹果树腐烂病菌、樱桃茎腐病菌、人参灰霉病菌等均具有较好的抑制效果[18-21]。丁香、肉桂、迷迭香的植物提取物对柑橘果实绿霉病、青霉病病原菌的抑菌效果较好[22]。石浩等[23]研究表明丁香和肉桂的丙酮提取物对猕猴桃果实软腐病主要病原菌具有较佳抑菌效果。本文将选取河北林人喜微生物制药有限公司自行研制的中草药源杀菌剂“轮纹一扫光”对苹果枝干轮纹病菌进行了室内毒力测定、离体枝条试验及田间防治药效试验，通过试验研究“轮纹一扫光”的防治效果，以便为果农提供有效防治该病害的首选药剂，为苹果优质高产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试病原菌 苹果轮纹病菌B. dothidea，由河北农业大学林木病理实验室提供，自河北省保定市易县南界安村苹果园发病的枝条上经分离、纯化后获得，在4 ℃冰箱中长期保存备用。

1.1.2 室内离体枝条试验所用枝条 试验所用枝条为采自河北省保定市易县南界安村苹果园的2年生、粗细一致、健康的富士苹果枝条。

1.1.3 田间防治试验苹果树 田间防治试验在河北省保定市易县塘湖镇南界安村苹果种植区内进行，选择树龄、树势及管理水平基本一致的富士苹果树作为试验对象。

1.1.4 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯浸粉7 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，1 L蒸馏水；马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA)：马铃薯浸粉7 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，1 L蒸馏水。

1.1.5 供试药剂 “轮纹一扫光”由河北林人喜微生物制药有限公司提供，其他4种对照药剂为生产常用化学药剂，自保定市农资市场购买。各种药剂的生产商和推荐稀释倍数见表1。

表1 供试化学药剂Table 1 The fungicides used in the experiments

1.2 试验方法

1.2.1 “轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用 采用菌丝生长速率法[24]。方法如下：在超净工作台上，吸取1 mL按推荐稀释倍数配置好的供试药剂，加入到温度为50 ℃～55 ℃的PDA 培养基（20 mL）中，充分摇匀，制成含药PDA培养基平板，同时对照为加等量无菌水的PDA培养基平板，分别设5个重复。待培养基完全凝固后，将培养好的病原菌用灭菌后的打孔器自菌落边缘打取直径8 mm大小的菌饼，分别接种到各含药培养基中间，将带有菌丝的一面朝下。将培养皿置于25 ℃培养箱中培养，待对照菌落生长直径达到培养皿直径的80%～90%时，用十字交叉法测量各培养基的菌落直径。菌落生长直径＝菌落直径－接种菌饼直径，抑菌率（%）＝（对照菌落平均生长直径－处理菌落平均生长直径）/对照菌落平均生长直径×100

1.2.2 “轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌产生分生孢子器的抑制作用 将苹果轮纹病菌用PDA培养基培养4 d，待菌丝刚长满培养皿时，用灭菌的打孔器自菌落边缘处打取菌落块，将菌落块带有菌丝的一面贴近含药PSA培养基，以接种不含药的培养基为对照。含药培养基的制作方法同1.2.1。接种完成后用封口膜将培养皿封好置于25 ℃培养箱中。待菌丝长满培养皿时刮除菌丝，置于黑光灯下培养20 d后，记录分生孢子器产生的数量。用镊子将苹果轮纹病菌分生孢子器挑出，置于65 ℃烘箱中烘至恒重后，用电子天平称量其干重。

1.2.3 “轮纹一扫光”对苹果轮纹病孢子萌发的抑制试验 分生孢子诱导及孢子悬浮液制备：采用苹果果实诱导产孢的方法，将苹果轮纹病菌接种到苹果果实上，置于25 ℃恒温培养箱中黑光灯下培养15 d后，自接种点向外开始产生黑色的小粒，即苹果轮纹病病菌的分生孢子器，随后在分生孢子器上溢出黄色的丝状物，即分生孢子角。用消毒的接种针挑取黄色分生孢子角与浓度为0.05% 的吐温-80混合后置于涡旋混合器上，充分震荡混匀。无菌水调整悬浮液浓度为每个视野下（10×10）有40～70个孢子，分装于3 mL离心管中备用。

采用玻片法[25]，将供试药剂稀释成推荐浓度后吸取150 µL置于载玻片的凹槽上，自然风干后，吸取30 µL孢子悬浮液滴在载玻片凹槽中，以吸取同量无菌水做对照，每种处理4次重复。处理后的载玻片置于培养皿中，用沾有无菌水的棉球置于培养皿内保湿，25 ℃黑暗培养箱中保湿培养。待对照的萌发率达到80%以上时（即4 h），观察记录每个处理的萌发率，每个载玻片随机观察5个视野，计算平均值。孢子萌发标准：芽管长度超过孢子直径长度的一半。孢子萌发率（%）＝（萌发孢子数/镜检孢子总数）×100，孢子萌发抑制率（%）＝（对照萌发率－处理萌发率）/对照萌发率×100。

1.2.4 离体枝条保护作用试验 剪取2年生、粗细一致、50 cm长的健康富士苹果枝条，清水清洗2～3次，用酒精将枝条表面消毒，然后再用无菌水冲洗。自然风干后将两头蜡封待用。采用烫伤接种法[26]，每根枝条用加热后的玻璃棒每隔5 cm烫伤一点，共烫伤5个点。每种处理重复6次。用蒸馏水将供试药剂稀释为推荐浓度，在烫伤伤口处用毛笔涂抹药剂，每次涂抹两遍保证伤口处药剂涂抹均匀，以涂抹无菌水为对照。晾干后在伤口处接种已培养4 d的菌饼（Φ＝8 mm），菌饼上缠绕浸有无菌水的脱脂棉保湿，用保鲜膜包裹菌饼处使其固定在枝条上。将所有供试枝条放在保湿盘内并于温度为25 ℃、相对湿度为65%～75%的人工气候箱中保湿培养24 h后，去掉保湿材料，7 d后统计发病情况，测量并计算各处理病斑面积和防治效果，发病率（%）＝（发病接种点数/总接种点数）×100，病斑面积＝1/4×π×长径×短径，防治效果（%）＝（对照病斑面积－处理病斑面积）/对照病斑面积×100。

1.2.5 离体枝条治疗作用试验 采用 1.2.4的方法将病原菌接种健康苹果枝条使其发病后，用不同药剂涂抹病斑，以涂抹无菌水作为对照。每隔3 d处理一次，共涂3次。将药剂处理过的供试枝条放在保湿盘内并于温度为25 ℃、相对湿度为65%～75%的人工气候箱中保湿培养。在第3次用药3 d后进行防效调查，分别用以下两种方法统计防治效果：（1）计算病斑面积，病斑面积＝1/4×π×长径×短径，防治效果（%）＝（对照病斑面积－处理病斑面积）/对照病斑面积×100；（2）分别从每种处理上分离30块病斑，重复3次。将病斑清洗、表面消毒后接种在PDA培养基上，在25 ℃恒温培养箱中培养3～4 d后开始观察病原菌生长情况，以单个病斑作为计数单位，统计各处理的分离率，分离率（%）＝（分离到的病原菌总数/总分离数）×100，分离率越小，防治效果越好。

1.2.6 田间药效试验 在河北省保定市易县塘湖镇南界安村苹果园，选取 10棵树龄、树势及管理水平基本一致且枝干发病情况一致的2年生苹果树作为试验对象，在每棵树有轮纹病斑且病斑大小基本一致的枝干用油漆笔标出30～50 cm2的区域（保证每个区域至少有30个病斑），每棵树标出4个区域，处理前对各个区域内苹果轮纹病病斑数量进行统计，对各个区域用油漆刷涂抹药剂两遍，使区域内药剂涂抹均匀并保证全部覆盖，分别进行以下4 种处理：①直接涂无菌水作为对照；②直接涂药；③刮除病斑后涂无菌水；④刮除病斑后涂药。每种处理10个重复，每隔10 d涂药一次，每次涂药前进行上次防效调查，共施药3次。第3次施药后一个月观察记录各区域复发病斑情况，计算防治效果，防治效果（%）=（第一次处理前病斑个数－第三次处理后病斑个数）/第一次处理前病斑个数×100。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel和DPS软件（Version 7.05）进行数据整理录入和统计分析，用邓肯氏新复级差法（P＜0.05）进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 皿内抑菌试验

2.1.1 “轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用 “轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用结果可以看出，5种杀菌剂对苹果轮纹病菌的菌丝生长均有一定的抑制作用，抑制效果明显不同，其中“轮纹一扫光”抑制效果最好，抑制率高达100%；其他4种药剂的抑制率由大到小依次为43%戊唑醇悬浮剂（97.80%）、10%苯醚甲环唑水分散粒剂（67.69%）、70%代森锰锌可湿性粉剂（58.46%）、50%嘧菌酯水分散剂（24.18%），“轮纹一扫光”相比其他杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用最好（图1，2）。

图1 供试杀菌剂对苹果轮纹病菌菌丝生长的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of the selected fungicides against mycelial growth of B. dothidea

图2 供试药剂对苹果轮纹病菌菌丝的抑制作用Fig. 2 Inhibitory effect of the selected fungicides against mycelial growth of B. dothidea

2.1.2 “轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌产生分生孢子器的抑制作用 “轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌产生分生孢子器的抑制作用结果表明，不同药剂均会不同程度抑制苹果轮纹病菌分生孢子器的产生，抑制作用越大，分生孢子器的数量和重量越小。其中“轮纹一扫光”的抑制效果最好，经其处理后未产生分生孢子器，其次为43%戊唑醇悬浮剂、50%嘧菌酯水分散粒剂、70%代森锰锌可湿性粉剂和10%苯醚甲环唑水分散粒剂，均与“轮纹一扫光”的抑制效果存在显著差异（表2）。由此可知，“轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌产生分生孢子器的抑制作用最好。

表2 不同药剂对苹果轮纹病菌分生孢子器产生量影响Table 2 Effects of different fungicides on the production of pycnidium of B. dothidea

2.2 “轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌孢子萌发的抑制作用

“轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌孢子萌发的抑制作用结果表明，抑制效果最好的药剂为“轮纹一扫光”，抑制率高达100%；其次为70%代森锰锌可湿性粉剂、50%嘧菌酯水分散粒剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂，抑制率分别为 98.53%、97.50%和 96.18%；43%戊唑醇悬浮剂对苹果轮纹病菌孢子萌发的抑制作用最小，仅为14.83%（表3）。由此可见，“轮纹一扫光”可以很好地抑制苹果轮纹病菌孢子萌发。

表3 供试杀菌剂对苹果轮纹病菌孢子萌发的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of the selected fungicides against spore germination of B. dothidea

2.3 离体枝条试验

2.3.1 保护作用试验 各供试药剂对苹果轮纹病菌离体枝条的保护作用结果表明，经过“轮纹一扫光”处理后的离体枝条，发病率较对照均降低了16.67%，平均病斑面积降低了119.64 mm2，防治效果为68.06%，相比50%嘧菌酯水分散粒剂、43%戊唑醇悬浮剂对苹果轮纹病离体枝条的保护效果较弱，而70%代森锰锌可湿性粉剂、10%苯醚甲环唑水分散粒剂相比“轮纹一扫光”较弱，防治效果分别为49.18%、47.58%（表4）。

表4 供试药剂对苹果轮纹病的保护作用Table 4 Protective effects of the selected fungicides to ring rot disease

2.3.2 治疗作用试验 将离体枝条烫伤接种发病后用供试药剂进行处理，试验结果见表5。经“轮纹一扫光”处理的枝条，平均病斑面积为13.22 mm2，防治效果为87.26%，43%戊唑醇处理的离体枝条防治效果为86.88%；不同药剂处理后病斑的分离率由小到大依次为：43%戊唑醇、“轮纹一扫光”、70%代森锰锌、10%苯醚甲环唑和50%嘧菌酯。分离率越小，药剂对苹果轮纹病菌的抑制效果越好，其病菌分离结果与药剂的防治效果基本一致。综上所述，“轮纹一扫光”对苹果轮纹病的治疗作用较好。

表5 供试药剂对离体枝条轮纹病的治疗作用Table 5 Curative effects of the selected fungicides to ring rot disease

2.4 “轮纹一扫光”对苹果枝干轮纹病菌的田间药效

“轮纹一扫光”对苹果轮纹病的田间药效试验结果见表6。从表中可以看出，刮除病斑后涂药，处理前病斑数量为32.67个，3次施药过后，没有复发的现象；不刮除病斑直接涂药，病斑个数没有明显变化，对苹果轮纹病的防治作用不明显；刮除病斑后涂无菌水，第一次处理前病斑数量为34.67个，由于刮除病斑，第二次处理前病斑数量为0个，但随着时间的延长，没有完全刮除的病斑出现复发，第三次处理前和处理后的复发病斑数量分别为2.33个、5个；对照处理前后病斑数没有明显变化。因此，“轮纹一扫光”在刮除病斑涂药后对苹果轮纹病菌抑制效果最明显，防治效果达100%。

表6 “轮纹一扫光”对苹果轮纹病菌田间药效试验的结果Table 6 Pesticide effect of “Lunwenyisaoguang” on B. dothidea in the field

3 讨论

本研究是以“轮纹一扫光”原液进行试验研究，结合“轮纹一扫光”药剂价格，设置不同的稀释梯度，在保证药剂防治效果的基础上，对“轮纹一扫光”最佳稀释倍数做进一步试验研究，以便取得更佳的防治效果。“轮纹一扫光”对菌丝生长、分生孢子器的产生、孢子的萌发有 100%的抑制作用，与赵刚等[27]提出韭菜提取液及其主要成分二甲基三硫和甲基烯丙基三硫醚在浓度达 1:4000 对苹果轮纹病菌生长具有100% 抑制菌丝生长的效果相同。戴忠良和高克祥[28]筛选出生防酵母菌株H3、T2、T3、Z8对苹果轮纹病菌抑菌作用强；侯晓杰和梁魁景[29]研究表明三七和五味子提取物浓度为0.25 g/L 时抑制苹果轮纹病菌的效果最好，抑制率分别为97.55%和86.27%，防效均不如“轮纹一扫光”。在离体枝条试验中“轮纹一扫光”对苹果轮纹病的保护作用效果不是很好，不适于作为保护性杀菌剂使用。在田间药效试验中，刮除病斑后“轮纹一扫光”的防效达到100%，但刮除病斑会对果树造成一定的弊端并且费时费力。张娣[30]在测定“柔脂通”渗透剂的渗透性时指出，“柔脂通”稳定性较好，对药剂的pH值有广泛的适应性，不会因不同药剂的酸碱变化而降低其渗透作用，且“柔脂通”渗透剂浓度为200倍液时，溶脂性和渗透性最好。在今后防治中可以将其与“柔脂通”渗透剂结合使用，使杀菌剂能够渗透到果树枝干深处，以便得到更好的防治效果。

“轮纹一扫光”属于中草药源杀菌剂，主要成分包括川乌、南星、乌梢蛇、防风、贯众及白芷[31]。该药剂安全、低毒、不易造成残留和破坏果园环境，使用便捷，对苹果枝干轮纹病菌有明显的抑制作用，具有很好的推广价值。植物源杀菌剂作为生物农药的一种，其取材于自然界的天然植物，与化学合成农药相比，在开发应用上有其独特的优势。“轮纹一扫光”作为一种植物源杀菌剂，可以通过对其主要的植物活性成分进行测定，研究其防治苹果枝干轮纹病的作用机理，为其防治提供一定的理论基础。