杨浦链霉菌WLU210的筛选、鉴定及其对苦瓜枯萎病的生防作用研究

张 涵，习慧君，赵玉华，万鑫茹，张园园，赵 莹，文才艺

（河南农业大学植物保护学院，郑州 450002）

苦瓜是我国重要的食用蔬菜之一，具有清爽的口感和良好的药用价值[1]。近年来，由于苦瓜种植面积不断扩大，重茬连作现象普遍，导致苦瓜枯萎病的发生和为害逐年加重，一般发病率为15%～25%，严重时高达60%～80%，甚至造成大面积绝收，严重影响苦瓜的产量和品质[2]。

目前，生产上对苦瓜枯萎病的防治主要以抗病品种选育与利用和化学防治为主。利用抗病品种来防治病害虽然经济有效，但由于目前生产上的苦瓜品种多为中抗或感病品种，高抗或免疫的品种缺乏，且新的抗性品种选育周期长，难以满足现实生产的需求[3-5]。化学防治作为植物病害防治的主要措施，具有见效快和适应性强等优点，但由于苦瓜枯萎病为典型的土传病害，防治难度大，多数化学药剂防治效果不佳。生产中，为了控制这种病害，常常使用化学农药灌根或处理土壤，容易导致农药残留、破坏土壤微生态环境和引发病原菌产生抗性等问题[6]；生物防治对环境兼容性好，方便与农业防治措施配合使用而达到可持续控制枯萎病的目的。因此，已成为目前苦瓜生产上，尤其是设施栽培中重要的防控措施。在苦瓜枯萎病生物防治研究方面，生防真菌和细菌的研究报道较多，如木霉Trichodermaspp.[7-9]、绿针假单胞菌Pseudomonas choloeaphtis[10]和多黏类芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa[11]等，有关生防放线菌防治苦瓜枯萎病的研究报道较少。李晓芳等[12]从健康苦瓜根际分离获得一株生防链霉菌，可通过抑制土壤中尖孢镰孢菌的数量来防治病害，对苦瓜枯萎病的田间防效达到62.1%。我们从河南黄河湿地土壤样品分离获得一株对苦瓜枯萎病菌Fusarium oxysporumf. sp.momordicae具有稳定拮抗活性的放线菌菌株WLU210，为了评估该菌株的生防潜力，本研究对该菌株分类鉴定、拮抗活性和生防效果进行了系统研究，以期为苦瓜枯萎病的生物防治提供有效的放线菌资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品 2017年5—7月分别从河南省郑州市、洛阳市、开封市和三门峡市的黄河湿地采集土壤样品共24份，供放线菌分离、筛选使用。

1.1.2 放线菌分离培养基 培养基M1-M8的配制参考文献[13-15]。

1.1.3 培养基 Potato Dextrose Agar（PDA）培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂粉15.0 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

1.1.4 苦瓜品种 如玉33号，购置于福建农科农业良种开发有限公司。

1.1.5 供试植物病原菌 苦瓜枯萎病菌F. oxysporumf. sp.momordicae、苹果轮纹病菌Botryosphaeria dothidea、小麦茎基腐病菌Fusarium pseudograminearum、辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici、西瓜炭疽病菌Colletotrichum orbiculare、小麦全蚀病菌Gaeumannnomyces graminisvar. tritici和玉米大斑病菌Setosphaeria turcica由河南农业大学植物病害生物防治实验室分离保存。

1.1.6 其他 试验所用药剂为50%多菌灵可湿性粉剂，购置于豫玉种业公司。

1.2 土壤放线菌的分离、纯化

称取2 g土壤样品溶于18 mL无菌水中，在180 r/min的摇床上振荡3 h后静置，吸取上清液制成10-1g/mL浓度土壤悬浮液，依次进行梯度稀释。分别吸取200 mL稀释度为10-3、10-4的土壤悬浮液到分离培养基（M1-M8）平板上，每个梯度重复3次，用无菌涂布棒均匀涂布，置于28 ℃生化培养箱中倒置培养。待培养5～7 d后观察菌落生长情况，用接种环挑选单菌落至高氏1号培养皿上纯化培养，并根据菌落形态特征和样品来源对分离得到的放线菌菌株去重复，将去重后的菌株用25%甘油在-80 ℃保存备用[16]。

1.3 拮抗菌株的筛选

1.3.1 拮抗菌株的初筛 以苦瓜枯萎病菌等7种植物病原菌为靶标菌进行拮抗放线菌筛选。将靶标菌菌饼（d＝5 mm）接种于直径为9 cm的PDA平板中央，在菌饼四周3 cm处接种不同放线菌菌株，于28 ℃生化培养箱中倒置培养，培养5～6 d后，观察并记录抑菌效果。

1.3.2 拮抗菌株复筛 以苦瓜枯萎病菌为靶标，对初筛得到的放线菌菌株进行复筛。将苦瓜枯萎病菌菌饼（d=5 mm）接种于直径为9 cm的PDA平板中央，在菌饼两边3 cm处划线接种相同菌株，以仅接种苦瓜枯萎病菌为空白对照，测定不同菌株对苦瓜枯萎病菌的抑菌效果，从中挑选抑菌效果最佳的菌株作为候选菌株进行后续试验。

1.3.3 菌株WLU210拮抗谱的测定 分别以苹果轮纹病菌、小麦茎基腐病菌、辣椒疫霉病菌、西瓜炭疽病菌、小麦全蚀病菌和玉米大斑病菌为靶标菌，按照1.3.1的方法与菌株WLU210进行对峙培养，观察并记录抑菌效果。

1.4 菌株WLU210的分类鉴定

1.4.1 形态特征观察 采用插片法观察菌株的基内菌丝、气生菌丝和孢子形态。菌株WLU210划线培养于高氏1号平板培养基上，28 ℃恒温培养箱培养，分别于培养5和9 d后取样，用扫描电镜（日立S4800）观察、拍照。

1.4.2 生理生化特征测定 参考《常见细菌系统鉴定手册》[17]中描述的方法测定菌株WLU210对不同碳源和氮源的利用情况、还原硝酸盐、亚硝酸的能力、分解纤维素和淀粉的能力、液化明胶和产H2S的情况等。

1.4.3 16S rRNA基因序列分析 采用CTAB法[18]提取菌株的总DNA，PCR扩增引物为27F（5′-AGAGTT TGATCTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）；PCR 扩增体系（25 μL）：2×EasyTaqMaster Mix 12.5 μL，DNA 模板 1 μL，10 μmol/L 引物各 0.5 μL，ddH2O 补足 25 μL；程序为94 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环35次；72 ℃延伸10 min。将扩增得到的产物送往上海生物工程技术服务有限公司测序。测序完成后将得到的序列在NCBI数据库进行BLAST比对，选取与其相似度较高的基因序列，利用MEGA 7.0软件构建系统进化树。

1.5 生防放线菌对苦瓜的促生和防病效果

1.5.1 菌株WLU210对苦瓜的促生效果测定 将菌株WLU210接种于100 mL高氏1号液体培养基中，28 ℃、180 r/min振荡培养 5～7 d后，发酵液用无菌滤膜过滤，滤液用灭菌的高氏 1号液体培养基稀释，得到WLU210孢子悬浮的浓度为106孢子/mL，待苦瓜幼苗长出两片真叶时，将制备好的WLU210孢子悬浮液按每株10 mL进行灌根接种；以接种高氏1号液体培养基为对照，处理后的苦瓜苗在28 ℃～30 ℃温室中培养，30 d后调查统计苦瓜株高、地上部分鲜重、根长和根鲜重等生理指标。

1.5.2 菌株WLU210对苦瓜枯萎病防治效果的盆栽试验 将苦瓜种子催芽后在室温内播种，待苦瓜幼苗长出两片真叶时进行灌根接种。菌株WLU210发酵液的制备按1.5.1所述。试验设置对照组和处理组，对照组：在苦瓜根部接种10 mL灭菌的高氏1号液体培养基，1 d后再接种10 mL病原菌孢子悬浮液（孢子悬浮液的浓度为106孢子/mL）至苦瓜根部；处理组：用10 mL WLU210发酵液对瓜根部进行灌根接种，1 d后再接种病原菌孢子悬浮液（孢子悬浮液的浓度为106孢子/mL）。所有处理的苦瓜幼苗置于28 ℃～30 ℃温室中培养，待对照组发病后，统计试验结果并拍照。试验重复3次，每处理8株苦瓜幼苗。

1.6 菌株WLU210对苦瓜枯萎病防治效果的田间试验

试验于2019年4月—2019年7月在河南农业大学原阳试验基地的苦瓜枯萎病病圃中进行。试验设置对照（CK）、生防菌处理和农药处理3个小区，每个小区25 m2，3个重复，共9个小区。对照小区常规管理；生防菌处理小区于苦瓜定植时穴施WLU210孢子悬液40 mL（孢子浓度为106孢子/mL），定植21 d后，用相同浓度的WLU210孢子悬液灌根处理，每株20 mL；农药处理小区于苦瓜定植时穴施50%多菌灵500～600倍液40 mL，定植21 d后，用相同浓度的多菌灵500～600倍液灌根处理，每株20 mL。根据田间苦瓜枯萎病发病等级分级标准[19]，在苦瓜种植后35和56 d时调查各小区发病情况，统计病情指数，计算生防菌株的田间防效。病情指数＝Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总株数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照病情指数×100。

2 结果与分析

2.1 拮抗放线菌的筛选

从河南省不同地区黄河湿地土样中共分离获得土壤放线菌330株，通过平板对峙法对分离获得的土壤放线菌进行筛选，获得13株对苦瓜枯萎病菌具有抑菌效果的拮抗菌株。初筛和复筛结果显示，菌株WLU210对苦瓜枯萎病菌的抑菌效果最佳，抑菌率为60.64%（图1），因此选定菌株WLU210进行后续研究。

图1 菌株WLU210对苦瓜枯萎病菌的抑菌效果Fig. 1 Inhibition activity of strain WLU210 to F. oxysporum f. sp. momodicae

2.2 菌株WLU210的拮抗谱

试验结果表明，菌株WLU210除了对苦瓜枯萎病菌具有良好的拮抗活性外，对供试的6种植物病原菌均具有较强的拮抗活性（图2）。

图2 菌株WLU210的拮抗谱Fig. 2 Antagonistic spectrum of strain WLU210

2.3 菌株WLU210的分类鉴定结果

2.3.1 菌株WLU210形态学特征 菌株WLU210在高氏1号培养基上生长良好，单菌落呈圆形点状，气生菌丝为浅灰色，基内菌丝为象牙色，无可溶性色素产生（图3a）。菌株基内菌丝无隔膜，不断裂；孢子丝以横割分裂的方式形成孢子（图3b），孢子呈圆柱状，表面光滑（图3c）。

图3 菌株WLU210的形态特征Fig. 3 Morphological characteristics of strain WLU210

2.3.2 菌株WLU210的生理生化特征 菌株WLU210的生理生化特征测定结果如表1所示：菌株WLU210能够利用葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为碳源，可以利用甘氨酸和精氨酸为氮源，可以分解纤维素、水解淀粉、液化明胶、但不产生H2S。在利用碳源方面，除了利用蔗糖的差异外，菌株WLU210与菌株杨浦链霉菌S.yangpuensisfd2-tbT（GenBank accession numbers，KP893387）[20]完全一致。

表1 菌株WLU210的生理特征测定结果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain WLU210

2.3.3 菌株WLU210的16S rRNA基因序列分析结果 菌株WLU210的16S rRNA基因序列长度为1394 bp（GenBank登录号：MG856016），将该序列在NCBI上进行BLAST检索，选取与其同源性较高的菌株序列进行建树比对结果所示，菌株WLU210与杨浦链霉菌亲缘关系较近，同源性达到100%（图4）。综合形态学、生理生化特征和16S rRNA序列分析比对，将菌株WLU210鉴定为杨浦链霉菌。

图4 基于16S rRNA基因序列构建的系统进化树Fig. 4 Phylogenetic tree of strain WLU210 based on 16S rRNA gene sequences

2.4 菌株WLU210对苦瓜的促生作用

菌株 WLU210对苦瓜地上部分的促生效果明显，株高和地上部分鲜重分别比对照提高了 73.31%和65.00%；与相比对照，根鲜重增加了14.00%（表2）。

表2 菌株WLU210对苦瓜的促生作用Table 2 Plant growth promoting effect of strain WLU210 on bitter gourd

2.5 菌株WLU210对苦瓜枯萎病的室内生防效果

苦瓜接种处理21 d后，只接种苦瓜枯萎病菌的对照组苦瓜出现叶片黄化，植株萎蔫等苦瓜枯萎病典型症状；经过生防菌处理后再接种病原菌的苦瓜长势良好，未出现苦瓜枯萎病症状。表明菌株WLU210对苦瓜枯萎病具有一定的生防效果（图5）。

图5 菌株WLU210的盆栽生防效果图Fig. 5 Biocontrol effect of strain WLU210 in pot experiments

2.6 田间小区试验结果

苦瓜旺长期，生防菌WLU210的防治效果为58.86%，随着病情的发展，生防菌WLU210的防治效果逐渐增加，至坐果期时，防治效果达到69.89%，与化学农药多菌灵的防治效果相当（表3）。结果表明，生防菌WLU210对苦瓜枯萎病有持续的防治效果。

表3 田间试验结果Table 3 Biocontrol effect of strain WLU210 against Fusarium wilt of bitter gourd in field trial（2019.6.25～7.16）

3 讨论

放线菌是重要的植物病害生物防治微生物资源，其中，链霉菌属Streptomyces及其相关类群是用于植物病害生物防治的主要放线菌类群[21]。在植物枯萎病生物防治方面，已报道的生防链霉菌包括弗氏链霉菌S.fradiae[22]、毒三素链霉菌S.toxytricini[23]、黄麻链霉菌S.corchorusii[24]、娄彻氏链霉菌S.rochei[25]、利迪链霉菌S.lydicus[26]等。随着可培养放线菌筛选工作的广泛开展，加之在筛选过程中普遍使用传统的菌种分离和鉴定技术，导致大量已知的普通分离菌株被重复分离和使用，因此，从一般生境中获取放线菌新物种或新活性物质的几率越来越小[27]。近年来，从海洋[28]、荒漠[29]和湿地[30]等特殊生境发掘新型放线菌资源已成为研究的热点。王皓等[31]从海洋生境中筛选出多株对黄瓜枯萎病具有较好防治效果的拮抗链霉菌。我们的前期研究工作表明，河南黄河湿地具有丰富的放线菌资源，且代谢途径多样，具有发掘放线菌新物种和新型活性物质的潜力[32]。基于此，本研究从河南黄河湿地分离的330株可培养放线菌中获得13株对苦瓜枯萎病菌具有拮抗效果的放线菌菌株，其中，具有生防应用潜力的菌株WLU210被鉴定为杨浦链霉菌。

杨浦链霉菌是链霉菌属的一个新种，由Tang等[20]于2016年首次分离、鉴定。我们首次从黄河湿地生境分离到杨浦链霉菌WLU210，盆栽试验结果显示，杨浦链霉菌WLU210可以有效促进苦瓜生长，尤其是对苦瓜株高和地上部分鲜重的促生效果最显著，同时对苦瓜枯萎病具有良好的防治效果；田间试验结果显示，菌株 WLU210处理后，苦瓜枯萎病的发病率和平均病情指数与对照相比，均显著降低，防治效果达69.89%。由此可见，作为苦瓜枯萎病生物防治的新型菌种资源，杨浦链霉菌WLU210具有良好的研发和应用潜力，有关该菌株对苦瓜枯萎病的生防机理还有待进一步研究。