沼泽红假单胞菌蛋白Rhp-PSP对烟草花叶病毒的系统抗性诱导及互作蛋白筛选

周寒梅，陈丽洁，翟忠英，张德咏,2，苏 品,2，刘 勇,2*

（1. 湖南大学研究生院隆平分院，长沙 410125；2. 湖南省农业科学院植物保护研究所，长沙 410125）

关 键 字：沼泽红假单胞菌；防御酶；抗病相关基因；蛋白互作

烟草花叶病毒Tobacco mosaic virus（TMV）是一种具有代表性的植物病毒，可侵染黄瓜、番茄、辣椒等350多个物种，每年造成巨大的经济损失，是仅次于黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus（CMV）的第二大优势病毒[1,2]。目前，TMV的防治措施主要为抗病品种选育、实行套种轮作等农业防治手段以及治蚜防病、药剂防治等化学手段[3]。但由于高抗品种选育难、防治效果不理想、抗药性、残留、食品安全等一系列问题，目前还未出现国际公认的抗TMV药物[4]。在当前的绿色农业背景下，生物防治由于其低毒、环境友好等特点已成为重点研究方向。用于生物防治的生防因子包括拮抗微生物、抗生素和植物诱导子等[5]。

光合细菌（Photosynthetic bacteria）是指可以在光照下进行光合作用的厌氧或兼氧生长的一类细菌[6]。作为一种生防菌在生物防治领域已得到广泛研究和应用[7]。研究人员发现光合细菌能诱导植物产生系统抗性[8]。如经过光合细菌处理后的蚕豆与苋色藜植株，对黄瓜花叶病毒、香石竹斑驳病毒的抗病性增强[9]，刘勇等[10]的研究发现光合细菌稀释液可有效防治田间辣椒病毒病；Su等[11]的研究表明，在烟草叶际施用光合细菌活菌悬液后，对TMV产生了明显的抗性。但大部分研究未对光合细菌发挥抗病作用的物质进行深入研究。前期试验证明，在光合细菌沼泽红假单胞菌菌液中发现了一种高氯酸溶性蛋白（perchloric acid-soluble protein，PSP），命名为Rhp-PSP，该蛋白属于YjgF/YER057c/uK114家族蛋白成员。该家族蛋白多参与细胞的基础代谢，生理生化功能多样，但功能背后的分子机制却不明确[12]。而在微生物中，该类蛋白的功能也被多是基于其蛋白结构与活性基团的假设[13]，对于其诱导抗病机制还有待研究。

研究发现蛋白Rhp-PSP不仅对TMV病毒粒子有直接抑制作用，且接种TMV前用Rhp-PSP处理过的烟草叶片，更能有效防控病毒的侵染，在100 μg/mL浓度下，Rhp-PSP对叶片的保护效果为76.5%[14]。因此，推测蛋白Rhp-PSP能诱导烟草产生对TMV的系统抗性，为进一步验证猜想，本研究通过检测烟草相关防御酶活性与丙二醛（MDA）含量变化、抗病相关基因的表达情况，初步筛选互作蛋白，旨在探讨蛋白Rhp-PSP诱导烟草产生系统抗性的作用机理，希望能够为光合细菌应用于生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株、质粒：酵母菌株Saccharomyces cerevisiaeY2HGold、Y187、载体pGBKT7-53、pGBKT7-Lam和pGADT7-T均购于CLONTECH公司；大肠杆菌E.coli感受态细胞DH5α购于擎科生物技术有限公司；载体pGADT7和pGBKT7均由湖南省植物保护研究所保存。

试剂及培养基：本氏烟cDNA文库构于上海欧易生物医学科技有限公司；BamHI/NdeI限制性内切酶、T4 DNA连接酶、聚合酶链式反应试剂盒、荧光定量 PCR试剂盒、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒购于TAKARA公司；过氧化物酶（POD）测定试剂盒，多酚氧化酶（PPO）测试盒，苯丙氨酸解氨酶（PAL）测试盒，丙二醛（MDA）测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所；LB液体培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl、pH 7.0～7.5；LB固体培养基：LB液体培养基中添加1.7%的琼脂粉；酵母完全培养基（yeast extract peptone dextrose，YPDA）：2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、0.003%腺嘌呤、2%葡萄糖。

酵母筛选培养基（synthetic dropout，SD）、色氨酸缺陷型酵母培养基（SD/-Trp）、亮氨酸和色氨酸缺陷型酵母培养基（SD/-Trp/-Leu）、色氨酸、亮氨酸和组氨酸缺陷型酵母培养基（SD/-Trp-His-Ade）和色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤缺陷型酵母培养基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）、X-α-gal，均购于CLONTECH公司。

仪器：Milli-QA10纯水机，法国Millipore公司；小型台式离心机5415C，德国Eppendorf公司；水平电泳仪，国产；超净工作台，苏州净化仪器设备厂；PCR仪，Eppendorf；凝胶成像系统，美国AlphaInnotech公司；pHS-818精密型酸度计，贵阳学通仪器仪表有限公司；自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；赛福PRX450D智能人工气候箱，宁波海曙赛福实验仪器厂；-80℃超低温冰箱，日本三洋公司；旋涡器，国产；摇床，国产；水浴锅，国产；其它小型仪器，国产。

1.2 蛋白Rhp-PSP的诱抗作用

1.2.1 蛋白 Rhp-PSP处理后烟草叶片中防御酶活性及抗病相关物质含量 挑选健康的 5周龄本氏烟草植株，设置4个处理组，分别是清水对照、Rhp-PSP+TMV、蛋白Rhp-PSP以及TMV，每个处理5株烟草，3次重复。蛋白处理方法喷施处理，将100 μg/mL的蛋白Rhp-PSP对烟草进行喷施处理，直至烟草叶片铺满细密的水滴，既不聚集也不流下，24 h后接种TMV病毒粒子。TMV接种方法为摩擦接种。分别于接种TMV后的第1、3、5和7 d时的烟草顶部叶片进行取样，检测烟草叶片中过氧化物酶POD、多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL以及丙二醛MDA含量的变化。

1.2.2 蛋白Rhp-PSP处理后烟草叶片中抗病相关基因的表达量 取健康的5周龄本氏烟草植株，蛋白处理以及TMV病毒粒子接种方法同1.2.1，本试验设置3个处理组，喷施蛋白Rhp-PSP后接种TMV（T1）、喷施清水后接种TMV（T2）和喷施清水后用清水摩擦接种（CK）。分别在TMV接种处理后第1、2、3、4 d收集叶片进行检测。每个处理5株，3次重复。

采用Trizol法[15]对烟草总RNA进行提取，使用TaKaRa公司的反转录试剂盒进行cDNA合成，以 cDNA产物为模板，Actin作为内参基因，使用全式金生物技术有限公司的 qPCRmix试剂盒进行基因表达量检测。抗性基因及内参基因的引物序列见表1。qPCR 程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。通过 2-△△Ct法计算病程相关基因PR-1、PR-3、PR-5以及PDF1.2的相对表达量，其中△△Ct=（待测组目的基因Ct值－待测组内参基因Ct值）－（对照组目的基因Ct值－对照组内参基因Ct值）。

表1 qPCR引物Table 1 The primers in qPCR

1.3 酵母双杂交筛选互作蛋白

1.3.1 诱饵质粒的构建 根据Rhp-PSP序列和pGBKT7载体序列设计带酶切位点的特异性引物，其中上游引物带 NdeI酶切位点（5'-TCAGAGGAGGACCTGCATATG GTTGAGCAGAAGCTCG-3'），下游引物带BamHI酶切位点（5'-CGCTGCAGGTCGACGGATCCTCAGGCGACCTCGAAC-3'）；并以实验室前期工作中保存的PET28A-RhpPSP质粒为模板进行PCR扩增，胶回收目的片段；分别对PCR扩增序列及pGBKT7载体进行NdeI和BamHI的双酶切，并胶回收线性化后的片段；T4 DNA连接酶构建连接体系，并将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑选单克隆并测序，对测序结果正确的克隆菌株进行质粒提取，即为诱饵载体pGBKT7-RhpPSP。

1.3.2 诱饵载体的自激活及毒性检测 采用LiAc法[16]制备酵母菌株Y2HGold的感受态细胞，将诱饵质粒pGBKT7-RhpPSP与pGADT7空载体共转化Y2HGold为自激活检测组，以含有pGBKT7-53和pGADT7-T质粒的酵母菌为阳性对照组，以含有pGBKT7-Lam和pGADT7-T质粒的酵母菌为阴性对照组。将转化后的菌液涂布于SD/-Leu/-Trp、SD/-Trp-Leu-Ade-His、SD/-Trp-Leu-Ade-His/x-α-gal平板上，置于30 ℃培养箱培养3～5 d，观察菌落的显色情况，确定诱饵蛋白是否具有自激活活性

将诱饵载体 pGBKT7-RhpPSP和对照空载体 pGBKT7分别转化 Y2HGold酵母感受态细胞并涂布于SD/-Trp平板，在30 ℃恒温培养箱中倒置培养3 d后，观察转化诱饵载体和对照载体的转化菌菌落大小以及生长状态，以判定诱饵蛋白是否对酵母菌株产生毒性。

1.3.3 酵母 cDNA文库筛选 采用 Mating杂交法进行酵母文库筛选，具体参照 CLONTECH公司的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手册。挑取新鲜培养的2～3 mm诱饵酵母菌落于50 mL SD/-Trp液体培养基中，30 ℃培养20 h。当OD600达到0.8时，离心并弃去上清液，用5 mL SD/-Trp重悬，将5 mL含诱饵载体的Y2HGold菌液和1 mL Y187 cDNA文库菌液加入含有45 mL 2×YPDA/Kan(50 ug/mL)液体培养基中，30 ℃摇床低速振荡培养24 h，在显微镜下(40×)观察到二倍体接合型后离心，用10 mL 0.5×YPDA培养基重悬后涂布于直径150 mm的SD/-Trp-Leu/ X-α-gal平板上，30 ℃避光培养5 d，随后将平板上的蓝色菌落转移到SD/-Trp-Leu-Ade-His/ X-α-gal平板上，30 ℃避光培养10 d。

挑取上述平板中直径超过2 mm的蓝色单菌落，于SD/-Leu/-Trp液体培养基中扩繁，提取酵母质粒并以 pGADT7 载体通用引物（F：5'-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3'；R：5'-GTGAACTTG CGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3'）进行 PCR鉴定文库阳性克隆，分析插入片段的大小并排除重复克隆。

将符合要求的阳性克隆进一步转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布于 LB固体培养基上(含50 μg/mL Ampicillin)，37 ℃过夜培养，挑选单克隆扩繁并进行测序验证；根据测序结果去除重复的克隆；再将筛选后的阳性克隆序列在NCBI数据库中进行Blast比对分析，初步获得候选基因信息。

1.4 酵母双杂交一对一验证

根据GenBank中同源基因的序列，设计PCR扩增的特异性引物，并加入特定的酶切位点。扩增获得对应全长基因序列后，将其插入 pGADT7载体中构建重组子。重组子分别与质粒 pGBKT7和 pGBKT7-RhpPSP共转化酵母菌Y2HGold，转化产物涂布SD/-Leu/-Trp平板，30 ℃培养箱培养3～5 d，观察菌落生长情况。挑取平板上生长的单克隆菌落溶于20 μL ddH2O中，即为初始菌液浓度，按4个浓度梯度(10-1，10-2，10-3和 10-4)对初始菌液进行稀释，接种于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板，以含有 pGBKT7-53和pGADT7-T质粒的酵母菌为阳性对照组，以含有pGBKT7-Lam和pGADT7-T质粒的酵母菌为阴性对照组，30 ℃培养箱培养3～5 d，观察菌落生长情况。

2 结果与分析

2.1 蛋白Rhp-PSP的诱抗作用

2.1.1 蛋白Rhp-PSP处理后烟草叶片中防御酶活性及抗病相关物质含量变化 通过检测蛋白Rhp-PSP处理后烟草防御酶活性变化，试验结果表明，经过Rhp-PSP处理后接种TMV的3种防御酶活性（PPO、POD、PAL）都普遍高于其他处理组，且PAL与POD的酶活性呈现先升高后降低的趋势，分别在5和7 d时达到酶活性最大值。与只接种 TMV组相比，Rhp-PSP+TMV组 PAL与 POD的酶活性分别提高 37.79%和54.50%，PPO酶活性则持续升高，第9 d时可高达62.84 U/mg。在MDA含量检测结果中，Rhp-PSP+TMV处理组中的MDA含量呈现先降低再升高，后又降低的趋势，而只接种TMV组的MDA含量则随时间持续上升（图1）。

图1 蛋白Rhp-PSP处理对烟草叶片防御酶活性及MDA含量的影响Fig. 1 Dynamic curve of protective enzyme activities and content of MDA after Rhp-PSP treatment in tobacco

2.1.2 蛋白Rhp-PSP处理后烟草叶片中抗病基因表达量检测 通过qPCR方法对蛋白处理后烟草中抗性基因表达量进行检测结果显示，抗性基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2在蛋白Rhp-PSP处理后的烟草中，表达量明显上调，在3 d表达量达到最高值，分别为空白对照组的4.9、3.9、8.6和7.7倍，接种TMV组的3.7、2.2、4.3和4.7倍（图2）。

图2 抗性基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2的相对表达量Fig. 2 Relative expression levels of PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2

2.2 酵母双杂交筛选互作蛋白

2.2.1 诱饵质粒的构建 经PCR扩增得到的Rhp-PSP序列，通过NdeI/BamHI双酶切，将Rhp-PSP构建至诱饵载体pGBKT7上获得重组质粒。对重组质粒pGBKT7-RhpPSP进行琼脂糖凝胶电泳检测（图3A）和双酶切验证（图 3B），结果与预测值相同。并经测序验证，结果和目的基因序列一致，说明已成功构建了酵母诱饵质粒pGBKT7-RhpPSP。

图3 重组诱饵载体pGBKT7-RhpPSP的PCR验证（A）及双酶切验证（B）Fig. 3 Dentification of the recombinants of pGBKT7-RhpPSP by PCR (A) and double enzyme digestion (B)

2.2.2 诱饵载体的自激活检测及毒性检测 将自激活检测组、阳性对照组、阴性对照组转化到 Y2HGold酵母感受态细胞后，在SD/-Leu/-Trp、SD/-Trp-Leu-Ade-His、SD/-Trp-Leu-Ade-His/x-α-gal平板上培养5 d结果表明，三组均能在 SD/-Leu/-Trp平板上正常生长（图 4A），说明质粒已共转化到酵母菌株中。在SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基上，自激活检测组同阴性对照组一样无法生长（图4B），并且在加了X-α-Gal的平板上只有阳性对照组变蓝色（图4C），表明所构建的酵母诱饵载体报告基因没有自激活活性。因此，构建的诱饵表达载体pGBKT7-RhpPSP可以用于后续酵母双杂交的筛选试验。

图4 重组诱饵载体pGBKT7-RhpPSP的自激活检测Fig. 4 Self-activating detection of the recombinants of pGBKT7-RhpPSP

在SD/-Trp平板上可观察到诱饵质粒的酵母菌同对照相比，两者在菌落生长速度、大小、形态以及数目上并没有明显的差异（图5）。结果表明，诱饵载体pGBKT7-RhpPSP对酵母菌株Y2HGold没有毒性。

图5 重组诱饵载体pGBKT7-RhpPSP对酵母菌株Y2HGold的毒性检测Fig. 5 Analysis of toxicity of pGBKT7-RhpPSP to yeast strain Y2HGold

2.2.3 酵母双杂交筛选互作蛋白 以pGBKT7-RhpPSP为诱饵筛选烟草cDNA文库，统计SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上共有51个蓝色阳性菌落，利用PCR鉴定cDNA文库插入片段的大小，舍弃500 bp以下的小片段，其余的阳性酵母质粒转化大肠杆菌 DH5α，并进行测序分析。根据测序结果，去除重复序列，最终获得了11个与Rhp-PSP互作的蛋白（表2）。

表2 与 Rhp-PSP 相互作用蛋白质的生物信息学分析Table 2 Bioinformatics analysis of proteins interacting with Rhp-PSP

2.3 酵母一对一验证结果

为了进一步验证相互作用，避免假阳性情况，构建诱饵载体 pGADT7-CP2410A、pGADT7-Cab10b、pGADT7-protein40、pGADT7-Cab10A、pGADT7-cab91R、pGADT7-protein7、pGADT7-Lhcb1、pGADT7-CAB7、pGADT7-GPI、pGADT7-HCF136、pGADT7-VAN3，与质粒pGBKT7和pGBKT7-RhpPSP共转化酵母菌 Y2HGold。结果显示，阳性对照（pGBKT7-53+pGADT7-T）正常生长，而阴性对照（pGBKT7-Lam+pGADT7-T）及11个诱饵质粒与pGBKT7共转化的单克隆菌株在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上均不能正常生长，说明所验证的诱饵载体均无自激活活性。pGADT7-Cab10A、pGADT7-GPI、pGADT7-VAN3诱饵载体与pGBKT7-RhpPSP共转化在4个不同浓度上均能长出白色菌落（图6）。由上述结果可知，筛选出的同源蛋白中GPI锚定蛋白、VAN3结合蛋白及叶绿素结合蛋白A与Rhp-PSP具有相互作用。

图6 蛋白互作验证Fig. 6 Verify protein interactions

3 讨论

抗性诱导是生物防治的途径之一，并作为一种防治农作物病害有效的方法被广泛研究[17]。蛋白是一种能介导植物获得系统抗性的物质。如Liang等[18]报道了大叶黄萎病菌的PevD1蛋白与Nbnrp1蛋白互作诱导烟草产生系统抗性，郭景红等[19]表明玫瑰黄链霉菌产生的诱抗粗蛋白能够诱导黄瓜抗病性的提升。付强等[20]以枯斑三生烟和普通烟为试验对象，采用半叶枯斑法以及田间试验，表明超敏蛋白不仅明显提高了烟草的抗性，还能有效促进烟株生长。

本研究通过蛋白Rhp-PSP诱导抗性试验结果表明，蛋白Rhp-PSP提高了烟草叶片防御酶的活性和抗病相关基因的表达，其中POD、PPO、PAL活性与植物抗病性密切相关[21]，PR-1、PR-3、PR-5在水杨酸（SA）信号通路中起重要作用，PDF1.2是茉莉酸/乙烯（JA-ET）信号通路的标志基因[22]，并降低了MDA的含量，MDA作为膜脂过氧化作用的指标，MDA的含量低，膜受损程度越小，相反则越大。综上所述，蛋白Rhp-PSP可诱导烟草产生对TMV的抗病性。为进一步探讨诱抗机理，我们对Rhp-PSP与烟草之间的互作情况进行探究。选用酵母双杂交方法筛选互作蛋白，确认pGBKT7-RhpPSP诱饵载体无自激活活性及无毒性后，用Mating法进行互作蛋白筛选。结果初步筛选到11个蛋白，通过酵母双杂交一对一进一步验证了叶绿素结合蛋白A、GPI锚定蛋白、VAN3结合蛋白与Rhp-PSP的互作。

叶绿素结合蛋白与植物的光合作用密切相关；Van3结合蛋白根据UniProt提供的GO功能注释分析为叶维管束、韧皮部或木质部组织发生相关蛋白；GPI锚定蛋白是一种在真核生物细胞膜表面普遍存在的蛋白质，最大特点是没有跨膜结构域和胞质尾区，通过翻译后修饰产生的GPI结构锚定在细胞膜上[23]。GPI锚定蛋白这类细胞表面受体研究较少，现在普遍认为，它们涉及细胞识别、生长、分化和程序性死亡等重要的生命过程[24]。Shen等[25]的研究表明GPI锚定蛋白与拟南芥FLS2关联，通过调节FLS2的积累和信号传导来调节植物免疫。Yu等[26]的研究揭示了植物多肽RALF被CrRLK1L型受体激酶与GPI锚定蛋白复合物识别，表明GPI蛋白可作为受体直接识别配体，介导植物细胞膜内外信号的转导。Li等[27]的研究表明GPI蛋白参与多种类受体激酶的转运及其质膜定位，并作为这些激酶的共受体感知外部信号。这一系列的研究结果表明，GPI锚定蛋白在植物信号识别与传导过程中具有重要作用。但还未见GPI锚定蛋白参与对TMV系统抗性诱导的报道。

本研究下一步将重点对GPI锚定蛋白进行体内和体外互作的进一步验证，明确其诱导产生系统抗性的通路以及其中的互作进程。本研究对深入了解沼泽红假单胞菌Rhp-PSP的基因功能及其参与的诱导抗性机制研究有重要意义。