基于IPTW法筛选高脂血症人群的差异肠道菌群

陈姝琴，王兴欣，赵娟娟，纪泽敏，赵焕虎

（民族医药教育部重点实验室 中央民族大学药学院 北京100081）

高脂血症（Hyperlipidemia，HLP）是指人体内脂质代谢障碍导致体内血脂异常，从而严重危害人体健康的疾病。高脂血症可引起动脉粥样硬化，是心血管疾病的主要危险因素之一[1]。降低胆固醇的药物主要通过抑制细胞内胆固醇的合成，加速低密度脂蛋白胆固醇的分解或减少肠道内胆固醇的吸收，如他汀类药物，虽然这些药物疗效确切，但是具有肝功能受损等副作用[2-3]。

人体内的微生物数量是人类细胞数的10 倍，其中肠道菌群的多样性由遗传和环境因素等共同决定[4]。肠道菌群通过产生代谢物影响宿主的代谢和健康，其中，主要通过短链脂肪酸、胆汁酸、氨基酸、内毒素等作用影响宿主的脂质代谢[5-7]。

大多关于高脂血症的研究停留在实验室阶段，临床试验还很少。有研究通过16S rDNA 测序技术分析不同物质对高脂血症大鼠或小鼠肠道菌群的影响[8-12]，而针对人的研究较少，具体的机制还需研究确认。

本研究对高脂血症患者与非高脂血症人群的肠道菌群进行高通量测序分析，利用逆处理概率加权法（Inverse probability of treatment weighting，IPTW法）校正混杂因素，通过QIIME2 ANCOM 找出高脂血症患者与非高脂血症人群之间的差异肠道菌群，并通过R Tax4Fun 包进行功能预测。

1 材料和方法

1.1 临床样本及纳入标准

本研究获得中央民族大学伦理委员会批准。132 例受试者样本均来自中央民族大学校医院参与慢性病体检和大肠癌筛查的教职工临床病例样本，均签署书面知情同意书。排除以下情况的人群：具有精神病史，滥用药物的人群；有手术或其它应急情况的人群；近期服用过抗生素或益生菌的人群（3 个月）；长期服用类固醇激素、甲状腺激素、避孕药和影响血清脂质参数的药类。根据《中国成人血脂异常防治指南（2016年修订版）》相关标准，符合其中一项或多项诊断为高脂血症：1）总胆固醇＞5.20 mmol/L；2）低密度脂蛋白胆固醇＞3.4 mmol/L；3）甘油三酯＞1.7 mmol/L；4）高密度脂蛋白胆固醇≤1.0 mmol/L[13-14]。

1.2 粪便样本采集、DNA 提取

采集受试者粪便样本，加入生理盐水，立即放在冰上进行分装、标记。每管样本300 mg，-80 ℃储存。根据强力土壤®DNA 提取试剂盒操作步骤提取DNA。分光光度计检测DNA 的浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和纯度，检测合格的DNA 于-80 ℃冰箱储存待用[15]。

1.3 仪器与试剂

正向引物、反向引物，上海英骏生物技术有限公司；4 种核苷酸、高保真DNA 聚合酶，美国EpochBiolabs 生物技术公司；DNA 纯化磁珠、DNA纯化试剂盒，上海百研生物科技有限公司；强力土壤®DNA 提取试剂盒，深圳安必胜科技有限公司；100 bp DNA 分子量标记、标记基因、去离子水，天根生化科技（北京）有限公司；无水乙醇，北京化工厂；Q5 超高保真DNA 聚合酶，新英格兰生物实验室公司；快速PCR 热启动超高保真DNA 聚合酶、DNA 聚合酶，北京全式金生物技术有限公司；KoDFX，东洋纺（上海）生物科技有限公司。

1795 微型离心机，天根生化科技（北京）有限公司；BC/BD-629HK 卧式冷藏冷冻转换柜、HYC-360 冰箱，海尔集团；G560E 振荡器，德国西门子股份公司；9902 96 well PCR，美国应用生物系统公司；5424EQ766751 24 孔离心机，德国艾本德股份公司。

1.4 16S rDNA 扩增与高通量测序

16S rDNA 的V3～V4 区PCR 扩增的上游引物为308F（5'- ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），下游引物为806R（5'- GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。反应体系（50 μL）：10 μL 缓冲液，0.2 μL Q5 高保真聚合酶，10 μL GC 增强剂，10 μmol/L 上游引物，10 μmol/L 下游引物，1 μL dNTPs，60 ng 基因组DNA，用ddH2O 补充至总体系50 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，退火时间30 s，退火温度从95 ℃到50 ℃，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共15 个循环，最后72 ℃延伸7 min。扩增产物使用AMPure XP磁珠纯化，目标区域PCR 纯化产物进行二次PCR扩增，最终的PCR 产物进行磁珠纯化、Nanodrop 2000 定量，琼脂糖凝胶（1.8%）电泳切胶回收，质量合格的文库用Illumina HiSeq 2500（2×250）测序。

1.5 数据处理和分析

将测序得到的原始数据以FASTQ 文件格式储存。用R 软件DADA2 包对原始数据量进行质量评估和去噪，去除和校正低质量序列，算法识别嵌合体，生成 扩增序列变体（ASV）表，代表序列比对Silva 参考数据库（Silva 123）[16]得到分类信息。物种组成分析、Alpha 多样性和Beta 多样性分析均基于自行编写的脚本在R 软件上实现。通过QIIME2 ANCOM 找到差异ASVs[17]。功能预测分析由R Tax4Fun 包完成[18]。预测的功能主要包括Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库中的基因。

1.6 统计分析

运用SPSS 25 对HLP 组与对照组进行独立样本t检验。运用R 对HLP 组与对照组除总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白以外的年龄、性别、舒张压、收缩压等临床指标进行IPTW 处理，校正混杂因素[19]。

2 结果与分析

2.1 组间临床信息与IPTW

本研究共包括94 例高脂血症人群和38 例非高脂血症人群。通过独立样本t检验（表1），胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯在两组间差异有统计学意义。使用IPTW法校正混杂因素，用标准差（Standardized mean differences，SMD）来衡量倾向性评分匹配（Propensity score matching，PSM）和IPTW 的结果。在IPTW 方法中，所有协变量的SMD 都小于0.1（图1）。

图1 倾向性评分匹配和逆处理概率加权的病例基线特征Fig.1 Baseline characteristics in case and control by PSM and IPTW

表1 132 例样本临床资料统计（±s）Table 1 Clinical information of 132 samples（±s）

表1 132 例样本临床资料统计（±s）Table 1 Clinical information of 132 samples（±s）

注：*. P<0.05；**. P<0.01。

特征描述分类对照组高尿酸血症组统计量P 值性别男1537t= -0.0120.991女2357胆固醇（4.23±0.505）mmol/L（5.6±0.992）mmol/L8.1090.001**高密度脂蛋白（1.44±0.268）mmol/L（1.43±0.369）mmol/L-0.0780.938低密度脂蛋白（2.46±0.465）mmol/L（3.6±0.762）mmol/L8.6530.00**甘油三酯（1.1±0.31）mmol/L（2.22±1.312）mmol/L5.2330.00**舒张压（79.34±10.963）mmHg（80.04±10.410）mmHg0.3450.731收缩压（143.11±21.896）mmHg（136.65±17.558）mmHg-1.7780.078体重指数（23.58±6.420）（25.37±5.580）1.5970.113腰臀比（0.83±0.208）（0.84±0.166）0.2880.774年龄（70.92±9.178）（68.1±10.251）-1.4760.142葡萄糖（6.2±1.175）mmol/L（6.41±1.775）mmol/L0.6890.492谷丙转氨酶（22.53±9.363）U/L（24.53±16.319）U/L0.7110.479肌酐（72.32±17.521）mmol/L（72.63±18.085）mmol/L0.0910.928血尿素氮（5.89±1.410）mmol/L（5.47±1.334）mmol/L-1.6140.109尿酸（329.11±71.728）μmol/L（353.91±86.532）μmol/L1.5630.121同型半胱氨酸（12.79±3.943）μmol/L（13.89±5.252）μmol/L1.1550.250

2.2 测序数据与评估

利用R 软件DADA2 包生成的ASV 表，共有20 295 个ASVs。最小reads 为24 642（图2a），每个稀疏曲线趋于平坦，最小样本量为131（图2b），此后物种积累曲线趋于平缓，过滤后，还剩4 561个ASVs。

图2 稀释曲线（a）和物种累计曲线（b）Fig.2 Rarefaction curve（a）and species accumulation curve（b）

2.3 肠道菌群的物种组成分析

在不同的分类水平（门、纲、目、科、属）对肠道菌群进行物种组成分析，共鉴定10 个门，212 个属。门水平上（图3a），HLP 组中拟杆菌门（47.75%vs.41.00%）高于对照组，厚壁菌门（45.25% vs.50.04%）、放线菌门（6.58% vs.8.54%）低于对照组。属水平上（图3b），平均相对丰度大于1%的优势菌属中，HLP 组中的拟杆菌属（36.08% vs.30.46%）、普氏菌属（7.53% vs.5.50%）、毛螺菌属（4.21% vs.2.26%）、Agathobacter（3.75% vs.3.28%）、Lachnoclostridium（3.35% vs.3.07%）含量高于对照组，粪杆菌属（6.63% vs.8.74%）、双歧杆菌属（5.60% vs.6.86%）、Subdoligranulum（1.65% vs.3.43%）、瘤胃菌属（1.09% vs.2.33%）、Alistipes（1.44% vs.2.25%）含量低于对照组。

图3 组间菌群门（a）、属（b）水平相对丰度柱状图Fig.3 Bar plots of the relative abundances of gut microbiota at phylum（a）and genus（b）level

2.4 菌群多样性分析

Alpha 多样性分析显示，HLP 组的物种多样性虽低于对照组但差异无统计学意义（辛普森指数：P=0.065，香农指数：P=0.13，逆辛普森指数：P=0.065，Chao1 指数：P=0.37）（图4）。基于jaccard距离矩阵和bray-curtis 距离矩阵的主坐标分析（PCoA）和非度量多维标度（NMDS）分析未发现明显的聚类，adonis 检验显示，两组间无统计学差异。

图4 Alpha 多样性分析Fig.4 Comparison of α-diversity indexes

2.5 高脂血症的差异菌群分析

在高脂血症组和非高脂血症组，利用QIIME2 ANCOM 共找到 7 个差异 ASVs（ASV_232、ASV_63、ASV_173、ASV_46、ASV_393、ASV_283、ASV_41）。ANCOM 的结果用W值来衡量组间差异显著性，W值越高代表该物种在组间的差异显著性越高。其中ASV_232 属于放线菌门的双歧杆菌属，ASV_63、ASV_173 属于厚壁菌群的粪杆菌属，ASV_46、ASV_393、ASV_41 属于拟杆菌门的拟杆菌属，ASV_283 属于厚壁菌门的瘤胃菌属（表2，图6）。

图6 高脂血症组和非高脂血症组的差异ASVsFig.6 Differential ASVs between the hyperlipidemia group and the non-hyperlipidemia group

表2 高脂血症组和非高脂血症组的差异扩增序列变体Table 2 Differential ASVs between the hyperlipidemia group and the non-hyperlipidemia group

以甘油三酯（TG）、胆固醇（CHO）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）为分组指标，通过QIIME2 ANCOM 寻找差异ASV。在CHO 组和LDC-C 组未找到差异ASV。在TG 组和非TG 组中，有一个差异ASV（ASV_422），其W值为2 167，属于厚壁菌门的毛螺菌科，未注释到属（图7）。

图7 甘油三酯组和非甘油三酯组的差异ASVFig.7 Differential ASVs between the TG group and the non-TG group

在HDL-C 组和非HDL-C 组中，共有18 个差异ASVs（ASV_9、ASV_15、ASV_28、ASV_36、ASV_50、ASV_56、ASV_80、ASV_99、ASV_153、ASV_45、ASV_636、ASV_243、ASV_109、ASV_516、ASV_13、ASV_74、ASV_96、ASV_259），其中ASV_9、ASV_28、ASV_36、ASV_50、ASV_80、ASV_99、ASV_45、ASV_243、ASV_516 均属于拟杆菌门的拟杆菌属；ASV_15 属于厚壁菌门的Agathobacter属；ASV_56、ASV_636 属于厚壁菌门的Subdoligranulum属；ASV_153、ASV_74 分别属于厚壁菌门的疣微菌科、毛螺菌科，未注释到属水平；ASV_109 和ASV_13 均属于厚壁菌门的毛螺菌科的Lachnoclostridium属；ASV_96 和ASV_259 均属于厚壁菌门的Lachnospiraceae_UCG-010 属（表3，图8）。

图8 高密度脂蛋白胆固醇组和非高密度脂蛋白胆固醇组的差异ASVsFig.8 Differential ASVs between the HDL-C group and the non-HDLC-C group

表3 HDL-C 组和非HDL-C 组的差异ASVsTable 3 Differential ASVs between the HDL-C group and the non-HDL-C group

2.6 高脂血症患者与对照组肠道菌群功能比较

对菌群进行功能预测分析，在KO1 水平上，代谢所占的相对丰度较高。在KO2 水平上共鉴定到41 个KEGG 通路，其中碳水化合代谢物通路所占的相对丰度较高，HLP 组高于对照组，无统计学意义差异。其次是氨基酸代谢通路，HLP 组低于对照组，也无显著差异。在KO3 水平上共鉴定到275 个KEGG 通路，ABC转运体所占的相对丰度最高，HLP 组低于对照组，其次是双组份系统，HLP 组高于对照组。

图9 组间功能预测比较分析Fig.9 Comparison of functional predictions between two groups

3 讨论

高脂血症是一种由于人体内脂质代谢紊乱导致脂质水平异常的代谢性疾病[1]，多数调脂药物都有肝功能受损等副作用。随着肠道菌群研究的深入，发现其具有重要的生理功能，且肠道菌群与多种疾病密切相关[1-3]。

本研究基于132 例临床样本，通过16S rDNA测序技术分析高脂血症患者与非高脂血症人群肠道菌群，找到差异菌群。

基于R DADA2 包生成ASVs 表，并对测序数据进行评估，过滤后还剩4 561 个ASVs，结果更接近真实情况。通过IPTW法校正混杂因素，使其达到临床对照试验的效果，并对ASVs 表进行加权处理，进一步减小混杂因素的影响。PSM 法虽然可以校正混杂因素，但是减少了样本量。物种组成分析中，在门水平上，无论是HLP 组还是对照组，拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门虽然都是优势菌，但是两组的比例不同，HLP 组中拟杆菌门高于对照组，厚壁菌门、放线菌门低于对照组。在属水平上，分析了平均相对丰度大于1%的优势菌属，其中HLP 组中的拟杆菌属、普氏菌属、毛螺菌属、Agathobacter、Lachnoclostridium含量高于对照组，粪杆菌属、双歧杆菌属、Subdoligranulum、瘤胃菌属_UCG-013、Alistipes含量低于对照组。Alpha 和Beta 多样性分析结果显示：两组无显著差异，而HLP 组的多样性略低于对照组。

在HLP 组和非高脂血症组中，利用QIIME2 ANCOM 共找到 7 个差异 ASV（ASV_232、ASV_63、ASV_173、ASV_46、ASV_393、ASV_283、ASV_41）。其中ASV_232 属于放线菌门的双歧杆菌属，ASV_63、ASV_173 属于厚壁菌门的粪杆菌属，ASV_46、ASV_393、ASV_41 属于拟杆菌门的拟杆菌属，ASV_283 属于厚壁菌门的Ruminococcaceae_UCG-013 属。其中在HLP 组中拟杆菌属含量高于对照组，而粪杆菌属、双歧杆菌属、瘤胃菌属含量要低于对照组。

分别以CHO、TG、HDL-C、LDL-C 为分组指标，通过QIIME2 ANCOM 找到差异ASVs。在TG组和非TG 组中，有一个差异ASV（ASV_422），W值为2 167，属于厚壁菌门的毛螺菌科，未注释到属。在HDL-C 组和非HDL-C 组中，共有18 个差异ASVs，其中ASV_9、ASV_28、ASV_36、ASV_50、ASV_80、ASV_99、ASV_45、ASV_243、ASV_516 均属于拟杆菌门的拟杆菌属，ASV_15 属于厚壁菌门的Agathobacter属；ASV_56、ASV_636 属于厚壁菌门的Subdoligranulum属；ASV_153、ASV_74 分别属于厚壁菌门的疣微菌科、毛螺菌科，未注释到属水平；ASV_109 和ASV_13 均属于厚壁菌门的毛螺菌科的Lachnoclostridium属；ASV_96 和ASV_259 均 属 于 厚 壁 菌 门 的Lachnospiraceae_UCG-010 属。

双歧杆菌是已知的与肠道胆汁酸和胆固醇代谢有关的细菌属，具有调节肠道微生态，如抑菌、免疫调节等有益作用[20-22]，目前关于瘤胃菌属的研究表明，瘤胃菌属是纤维素分解细菌，降解纤维素和半纤维素的细菌。在Chen 等[23]的小鼠研究中，试验组（发酵胡萝卜汁组）的瘤胃菌属含量高于对照组。瘤胃菌属_UCG-013 被认为是有益的类群[24]，与疾病严重程度呈负相关，是短链脂肪酸的产生者，其丰度与炎症和T2DM 呈负相关。瘤胃菌属以其产丁酸盐的特性而著称，对膳食纤维和碳水化合物的分解和利用效率较高。丁酸显著逆转活性氧（ROS）的产生，提高了抗氧化酶（SOD）的水平[23-27]。在Chen 等[28]和Ren 等[29]的研究中，也发现瘤胃菌属的变化，瘤胃菌属_UCG-013 的减少与碳代谢受阻有关，在调节碳水化合物的代谢途径中起作用，这可能会影响宿主的消化。本研究说明瘤胃菌属可能在高脂血症中发挥重要的作用。粪杆菌属是抗炎症相关菌，Giorgio 等[30]研究表明，血脂参数的变化与特定细菌类群的丰富度改变有关，其中包括瘤胃菌属、粪杆菌属。Subdoligranulum是短链脂肪酸产生菌，有研究在PE 患者中发现的肠道菌属Blautia，Eubacterium_rectale，Eubacterium_hallii，Collinsella和Subdoligranulum的减少主要是产生丁酸的细菌，这些患者中丁酸的减少可能是由这些粪便细菌的缺乏引起的[31-33]。此外，戊酸与GM 的关系似乎比丁酸更紧密，即：戊酸与更多属于厚壁菌属正相关，而与更多属于普氏菌属负相关，表明粪便中的戊酸水平可能可以作为转基因营养不良的敏感指标[32]。在这两篇文章中，发现毛螺菌属组成发生变化[34-35]。Omar 等[36]研究发现与健康个体相比，胃肿瘤患者的粪便中肠杆菌科水平升高，而直肠肿瘤患者粪便中的双歧杆菌水平较低；在患有结肠肿瘤的患者中观察到较低的乳杆菌科的丰度，在癌症治疗后取样的GIT 患者的粪便中乳酸杆菌的丰度更高；除了位点特异性差异外，患有肿瘤的患者中都存在高丰度瘤胃球菌及Subdoligranulum菌和低丰度的Lachnoclostridium和Oscillibacter菌。

4 结论

综上所述，高脂血症患者肠道菌群相比非高脂血症人群出现结构和丰度变化，通过QIIME2 ANCOM 找到以下差异肠道菌群，毛螺菌科、疣微菌科，双歧杆菌属、粪杆菌属、拟杆菌属、瘤胃菌属_UCG -013、Agathobacter、Subdoligranulum、Lachnoclostridium、Lachnospiraceae_UCG-010 属，功能预测结果表明碳水化合物代谢和氨基酸代谢所占比例较大。以期为高脂血症的预防和诊疗提供科学的参考。